Профилирование Предварительно микро-РНК и микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени (КПЦР) Массивы

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы обеспечить быструю и надежную автоматическую настройку массивов на основе QPCR. Это достигается путем предварительной подготовки наборов праймеров для массива и настройки образцов мастер-миксов для просеивания. Затем используется либо автоматизированная роботизированная ПЦР-установка, либо матричная электронная система дозирования для точного набора образцов Eloqua, мастер-микса и праймера в каждую лунку 384-луночного планшета.

После приготовления 384-луночные ПЦР-реакции запускаются с помощью программы ПЦР на основе кибернетической ПЦР на основе легкого амплификатора four 80. Заключительным этапом процедуры является анализ данных QPCR и определение относительных уровней экспрессии для каждой тестируемой пары праймеров, каждая из которых нацелена на определенную мРНК. В конечном итоге можно получить результаты, которые показывают изменения в экспрессии больших наборов мРНК.

Таким образом, специально разработанные матрицы могут нацеливаться на целые профили премикроРНК, конкретные пути или молекулы, являющиеся ключевыми для вирусной инфекции, с помощью профилирования на основе ПЦР. Здравствуйте, я Дирк DMA из факультета микробиологии и иммунологии Университета Северной Каролины в Чапел-Хилле. Сегодня мы покажем вам, как настроить QQPC rra в реальном времени, и покажем два метода.

Один — с помощью пипетки нестандартной формы, а другой — с помощью робота. Мы используем эту технологию для измерения премикроРНК и зрелых микроРНК в опухолях человека. Сегодняшнюю демонстрацию проведут Полин Чу и Кристен Бу.

Итак, приступим. Чтобы начать эту процедуру, извлеките капсюльные пластины, содержащие 186 пар грунтовок в 96. Хорошо отформатируйте при 0,5 пикаМоле при температуре минус 20 градусов по Цельсию.

После размораживания пластин при комнатной температуре, сделайте вихревую деформацию и быстро центрифугируйте их. Также разморозьте cyber green два раза ПЦР микс при комнатной температуре для установки каждой 96 луночных праймерных тарелок потребуется четыре мастер-пробирки для смешивания. Приготовьте мастер-смесь, смешав четыре микролитра кибер-зеленой смеси, три микролитра воды для ПЦР и от 10 до 20 нанограммов образца ДНК или КДНК на одну реакцию в каждой из четырех двухмиллилитровых пробирок эйнора.

Каждая пробирка должна содержать достаточное количество исходной смеси примерно для 100 реакций, с учетом избытка отходов пипетирования. Вихревыми трубками эйнора перемешать. Начните настройку анализа микроРНК-прекурсора с помощью робота freedom Tecan EVO с инициализацией робота и загрузкой программы износа EVO.

Затем трижды промойте робота 30 миллилитрами системной жидкости, чтобы очистить систему от пузырьков воздуха, которые будут мешать точности пипетирования. Затем настройте роботизированную платформу так, чтобы она включала в себя 384-луночную пластину и 96-луночную грунтовочную пластину. Мастер смешивает корыто с 2% отбеливателем, заполненную систему, контейнер для жидкости и пустой контейнер для отходов.

Начните автоматический запуск робота, дважды выбрав «Запустить» в конце программы. Снимите пластину лунки 384 и загерметизируйте световым циклером четыре потолочной пленки 80. Затем центрифугируйте пластину.

Ненадолго поместите герметичную пластину на 384 лунки в положение одного из отелей. Затем повторите этот процесс для второй грунтовочной пластины с новыми мастер-смесями и новой 384-луночной пластиной. Поместите получившуюся запечатанную мировую пластину 384 в положение два отеля.

Откройте новую программу износа EVO для загрузки легкого амплийлера из отеля и установите параметры езды на велосипеде. Затем дважды выберите «Выполнить». Freedom Evo автоматически загрузит каждую пластину в световой амплификатор и запустит велосипедную программу cyber green one HRM.

После завершения. Просмотрите и проанализируйте результаты, как описано в письменном протоколе, в качестве альтернативы использованию робота. Матричная электронная многоканальная пипетка может быть использована для начала помещения содержимого основной пробирки для смешивания в резервуар.

Настройте электронную пипетку на аспирацию 16 микролитров основной смеси с двумя этапами дозирования по восемь микролитров, за которыми следует этап продувки. После установки пипетки отаскайте 16 микролитров основной смеси и начните дозировать в колесную пластину на 384 колеса. Распределите первые восемь микролитров по каждой второй строке в первом столбце, используя строки от A до O, оставив следующий столбец пустым.

Вторые восемь микролитров распределите в те же ряды третьего столбца. Затем продуйте контейнер для мусора и утилизируйте чаевые, следуя этой схеме, оставляя чередующиеся строки и чередующиеся столбцы. Распределите по пластине еще на пять циклов, чтобы сделать пипетку мастер-миксом два.

Используйте те же строки, что и в первом основном миксе, но начните со второго столбца. Повторите эту процедуру для мастер-миксов три и четыре, начиная с первого и второго столбцов соответственно, но на этот раз с использованием розы B to P. Ее цитирование грунтовочной пластины. Установите электронную пипетку на аспирацию двух микролитров и дозируйте два микролитра с последующим этапом продувки.

Перенесите два микролитра грунтовки из колонны с первого ряда A в H 96-луночной грунтовочной пластины в каждую другую колонну для стрижки по одной из 384-луночной пластины, продуйте над контейнером для отходов и утилизируйте наконечники. Повторите эту схему для праймера quatt для трех оставшихся мастер-миксов первого и второго столбцов. Затем продолжите этот процесс для колонн со второй по 12 из 96-луночной грунтовочной пластины, перемещаясь через каждые две колонны в 384-луночной пластине для каждой праймерной колонны.

Далее запечатайте пластины легким потолочным амплификатором, фольгой и центрифугой. Вскоре после центрифугирования. Поместите пластины в световой амплификатор 4 80 и циклируйте пластины с помощью кибер-зеленого формата обнаружения одного HRM.

Используя те же условия цикла, что и раньше, повторите эту процедуру, используя грунтовочную пластину два Eloqua в свежую 384-луночную пластину с использованием свежеприготовленных мастер-смесей. Сигнатуры микроРНК-предшественников выявляются путем профилирования с использованием нового массива на основе QPCR. Была рассчитана средняя дельта CT, нормализованная до U six, и стандартизированные значения были загружены в массив.

Второстепенное программное обеспечение, создающее три отдельных кластера, отображаемых в виде тепловых карт. Относительная экспрессия каждой микроРНК-предшественника показана красным и синим цветами, представляющими собой увеличение и уменьшение относительной экспрессии соответственно. Интенсивность цвета указывает на степень изменения выразительности.

Большинство микроРНК-предшественников претерпели небольшие, незначительные изменения, как и ожидалось. Тем не менее, небольшая часть микроРНК-предшественников значительно увеличилась на протяжении всего эксперимента. Кроме того, относительный уровень некоторых предшественников микроРНК резко снизился.

В некоторых случаях. Они также группируются вместе при анализе тепловой карты. В зависимости от эксперимента могут возникать кластеры, зависящие от вирусной инфекции, специфической экспрессии типа клеток микроРНК-предшественников или микроРНК-предшественников, которые регулируются общей молекулой или сигнальным путем.

Показаны средние пороговые значения цикла или cts из отрицательного образца вируса герпеса, ассоциированного с саркомой Поузи, работающего с четырехкратным дубликатом. Важно отметить, что ассоциированный с саркомой вируса герпеса Капоши латентный ядерный антиген или KSHV Lana не был обнаружен в этом образце с помощью высокочувствительной матрицы QPCR. Тем не менее, как внутренний контроль U six, так и let seven a высокоэкспрессированная микроРНК предшественника человека, экспрессировались на обнаруживаемых уровнях.

Наконец, как и ожидалось, отрицательный контроль воды ПЦР-качества не дал продукта A-Q-P-C-R. Анализ кривой плавления для двух разных грунтовок. С использованием той же выборки отображается дубликат.

Понятно, что температура плавления различна для двух пар грунтов, но образец плавится при одинаковой температуре для каждой реплики. Признаки плохого или потенциально загрязненного образца могут включать несколько пиков плавления, что указывает на наличие двух разных источников входа. Мы только что показали вам, как настроить эксперименты QPCR в реальном времени с помощью робота.

Важно, чтобы вы включили все элементы управления и как можно больше генов домашнего хозяйства. Так что спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.