В естественных изображений интактного личинки дрозофилы на субклеточном Резолюцию

Прорывы в оптической визуализации и в генетически закодированной силе гриппа позволили ученым изучать биологические процессы, которые их интересуют, в живом организме, а в некоторых случаях даже в организме, ведущем себя. В то время как большое внимание уделялось изучению мозга млекопитающих in vivo, наша лаборатория использует довольно простую модельную систему, трофическое нервно-мышечное соединение, и в следующем видео мы объясним, как делать анестезию и визуализировать пробные личинки плодов, чтобы проследить развитие отдельных синапсов с течением времени, в течение нескольких часов. до суток в качестве метода изучения развития пищи. Ави действительно существуют, которые должны быть представлены, и протокол отказа от курения характеризуется следующими ключевыми особенностями.

Прежде всего, при очень высокой степени анализа останавливается даже сердцебиение, что имеет важное значение для высокого качества изображения. Во-вторых, приживаемость в 95% и возможность получать очень чувствительные изображения. Следующий протокол позволяет нам, например, изучить динамику глутаматных рецепторов, помеченных GFP и экспрессируемых на физиологических уровнях их эндогенными промоторами.

Теперь вы узнаете, как поместить личинки в камеру визуализации, как обезболить плод для личинок, как найти определенное положение внутри личинок для изображения лестницы регистрации, а затем также как извлечь личинки из ловушки. Перед визуализацией in vivo важно промыть личинок. Несмотря на то, что этот процесс прост, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить личинки, и поэтому щипцы никогда не используются для их перемещения.

Вместо этого мы выбираем мягкие движения щеткой. Вода, используемая для стирки, имеет комнатную температуру, и это обычная водопроводная вода, которая не дистиллируется и не содержит никаких моющих средств. Мы видим вас.

Он аккуратно перемещает личинок из корма в свежую воду из-под крана, чтобы получить хорошие результаты. Также жизненно важно как можно дольше удерживать личинок в воде. Это предотвратит попадание воды в трахею, что затрудняет дыхание, а также процесс обезболивания.

Далее подготавливаем камеру визуализации. Сначала наносим очень тонкий слой масла на нижний элемент камеры. Затем мы помещаем личинки поверх этой пленки масла.

Здесь важно позаботиться о том, чтобы окончания не касались масла. После того, как вы расположитесь, мы помещаем здесь распорную сетку поверх личинок. Важно, чтобы три канала были обращены вверх и таким образом позволяли подносить воздух к личинкам и не забиваться маслом.

Теперь мы надеваем крышку на верхнюю часть распорки и проверяем, правильно ли расположена личинка. То есть вентральная сторона обращена вниз, а трахея заканчивается дорсальной стороной, где мы можем видеть, что трахея обращена вверх. Теперь мы поместили сверху пластиковое адаптивное кольцо, а также металлическое кольцо, чтобы лава плавно прижималась между двумя стеклянными предметными стеклами.

Теперь мы закрываем камеру визуализации и перемещаем ее в конфокальный микроскоп, чтобы начать визуализацию. Теперь вы размещаете камеру визуализации с установленными личинками. В верхней части нашего конфокального микроскопа.

Из камеры визуализации выходят три трубки. Один из них присоединяется к обезболивающему средству дисфтору. Одна из них представляет собой выпускную трубку, а последняя трубка позволяет свежему воздуху поступать к личинкам.

После подключения камеры для личинок к обезболивающему устройству важно убедиться в правильном положении личинки. Затем Яо позволяет воздуху поступать в систему обезболивания через насос. В это время важно следить за тем, чтобы давление в камере не превышало максимально рекомендуемого.

Затем он опускает выпускную трубку в воду, чтобы обеспечить приток воздуха. Пузырьки в бутылке с водой демонстрируют воздушный поток. Теперь он медленно открывает клапан и позволяет фтору ненадолго течь через трубки.

После первичной анестезии важно проверить, как реагирует лава. Если сердце все еще бьется, необходимо провести дополнительную анестезию, как это видно. В следующем разделе мы покажем вам лаву под микроскопом.

Теперь мы можем увидеть важнейшую часть процесса анестезии под микроскопом. Первоначально можно увидеть движения личинок при том, что мышцы продолжают сокращаться. Как только движения начинают замедляться, я сканирует вверх и вниз личинок и наблюдает за происходящей анестезией.

Движения замедляются и, наконец, останавливаются. После применения нескольких импульсов анестезии мы видим, что лава перестала двигаться, и единственное видимое движение происходит из-за изменений в микроскопе. Чтобы определить степень обезболивания, важно проверить сердцебиение.

Хэ Яо сосредотачивается глубоко в лаве, где в основном можно увидеть толстое тело. Важно отметить, что область, окружающая сердце, может быть видна, и очевидно, что сердцебиение было остановлено, и, таким образом, личинки готовы к визуализации. Одной из основных трудностей при визуализации in vivo является идентификация нервно-мышечного соединения, которое вас интересует.

Чтобы помочь вам в этом, мы покажем, как это выглядит, когда вы сканируете личинки. Затем вы можете увидеть нервно-мышечное соединение, которое мы обычно используем для визуализации. Теперь мы начинаем медленно фокусироваться на личинках.

Начиная с поверхности кутикулы, вы увидите, как некоторые мышцы появляются и исчезают. Некоторые из них выделены. В фильме показана искусственная конструкция слияния, содержащая трансмембранный домен CD eight, GFP и концевую область C белка Iron Channel Shaker.

Этот конструкт локализуется на всех мышечных мембранах и демонстрирует повышенное присутствие в нервно-мышечном соединении. Теперь мы будем воспроизводить фильм медленнее, и с помощью рисунков два и три вы можете идентифицировать отдельные мышцы по мере их появления и исчезновения. Хотя эти мухи особенно полезны для изучения визуализации in vivo, мы обычно используем маркеры, экспрессирующие личинки, обозначая только постсинаптические или пресинаптические области синапса.

Поскольку они не покрывают всю мышечную поверхность, гораздо труднее определить одно и то же положение у личинок. В этом фильме мы показываем рецепторы глутаматной метки RFP. В фильме показано, как мы сосредоточиваемся на лабе, и мы выделяем отдельные нервно-мышечные соединения.

Мы покажем фильм еще раз медленнее, и вы сможете определить отдельные нервно-мышечные соединения с помощью рисунка четыре, чтобы помочь вам. Теперь у нас есть теория. Продемонстрируем практический пример.

Теперь мы сосредоточимся на нервно-мышечном соединении 27 в нашем вибростенде MHC CD eight GFP, экспрессирующем личинки. После увеличения цифрового зума мы перемещаем нервно-мышечное соединение, а затем перемещаемся в направлении C к центральной области, чтобы убедиться, что личинки расположены правильно и что у нас нет избыточных или ненасыщенных пикселей. Перенасыщенные пиксели отображаются красным цветом, а ненасыщенные пиксели отображаются синим.

Уменьшаем мощность лазера и проводим повторное сканирование. Теперь у нас есть соответствующее усиление и мощность лазера, и, таким образом, у нас больше нет перенасыщенных областей. Теперь важно отметить положение нервно-мышечного перехода в направлении С.

Сначала мы отмечаем нижнюю позицию сканирования, а затем верхнюю позицию сканирования, чтобы обеспечить точную запись всего стека CST. Обычно мы используем размер пикселя 100 нанометров на 100 нанометров, а расстояние в C составляет 500 нанометров. Если мы не планируем завершать деконволюцию после визуализации для обработки наших изображений, усиление устанавливается на соответствующий уровень, чтобы предотвратить шум, но также позволяет использовать более слабый лазер для минимизации обесцвечивания после завершения стека CST.

Нервно-мышечное соединение, экспрессирующее конструкцию M-H-C-C-D-H GFP шейкера, регистрируется надлежащим образом. В следующем разделе мы завершим аналогичный процесс, сосредоточившись на глутаматных рецепторах. Чтобы записать глутаматные рецепторы RFP-метки, мы снова фокусируемся через кутикулу и теперь видим отдельные нервно-мышечные соединения в сегменте А три.

Увеличив масштаб правого нервно-мышечного соединения, мы перемещаем его к центру поля зрения. Как было сделано ранее, нам нужно убедиться, что у нас нет перегруженных или ненасыщенных пикселей. Опять же, становится очевидно, что часть пикселей перенасыщена, поэтому мы корректируем настройки и завершаем еще одно тестовое сканирование.

Прирост мощности лазера теперь регулируется правильно. Теперь важно задать ограничения стека CST, определив верхнюю позицию и проверив ее, а затем нижнюю позицию. Теперь мы можем начать сканирование отдельных плоскостей нервно-мышечного соединения.

Важно сделать несколько пустых снимков участков чуть ниже и выше нервно-мышечного соединения, чтобы не пропустить некоторые синапсы, расположенные там. После того, как конфокалы закончат сканирование, мы спроецируем нервно-мышечное соединение, чтобы увидеть типичный результат, полученный при визуализации in vivo. Важно сохранить это изображение для сравнения со сканированием, выполненным в более поздние моменты времени, чтобы повторно идентифицировать нервно-мышечное соединение и можно идентифицировать изменения, такие как новые синапсы или синаптические палочки.

После успешной визуализации. Важно быстро разбудить лаву и быстро удалить ее из камеры визуализации. Сейчас Яо завершает эту работу, постоянно наблюдая за лавой, он настраивает устройство для обезболивания таким образом, чтобы в системе циркулировал свежий воздух, а не только фтор.

Теперь он помещает выходное отверстие камеры в воду, и пузырьки воздуха демонстрируют, что воздух проходит через систему. Он постоянно следит за личинками, чтобы убедиться, что сердцебиение снова начинает биться и личинки просыпаются. Аналогично процессу обезболивания, лучше всего обеспечить личинкам многократные импульсы воздуха, чтобы обеспечить успешное пробуждение.

Теперь мы можем видеть, что вы делаете, через микроскоп. Мы видим, как он подает воздух в систему. В камере возникают изменения давления, которые вызывают у личинок искусственные движения.

В конце концов, личинки начинают двигаться самостоятельно, и это лучше всего проявляется в инициировании сердечных движений, и поэтому мы фокусируемся внизу, в лаве, чтобы видеть эти движения более четко. Можно заметить ритмичные удары, свидетельствующие об успешном пробуждении личинок. После успешного пробуждения личинки важно извлечь ее из камеры визуализации.

Личинки находятся в нижней части камеры, и поэтому верхняя размещается в стороне. Yara снимает металлический груз и пластиковую крышку. Затем снимается крышка затвора, а впоследствии и пластиковая прокладка с личинками.

Он аккуратно удаляет личинки из пластиковой распорки с помощью щетки. Затем он ненадолго опускает его в воду и высушивает, чтобы удалить излишки масла. Теперь лаву помещают в предварительно измельченную пищу и оставляют там до тех пор, пока она снова не понадобится.