Методы экспериментальных манипуляций после оптические Перерезка нерва в ЦНС млекопитающих

Ганглионарные клетки сетчатки (ГКС) представляют собой нейроны центральной нервной системы, которые передают зрительную информацию от сетчатки в головной мозг через зрительный нерв. В сопровождающем видео был продемонстрирован метод экзодомизации, или перерезания аксонов всей популяции ГКС, в качестве модели апоптотической гибели нейронов в центральной нервной системе взрослого организма. В данной работе этот метод сочетается с процедурами по направленной доставке нейротрофических факторов, малых интерферирующих РНК, плазмид или вирусных векторов, кодирующих антиапоптотические белки, непосредственно в поврежденные ганглионарные клетки сетчатки или в сетчатку в целом для глобального воздействия на нее.

Сборка и использование аппарата для интраокулярных инъекций позволяет вводить вещества в стекловидное тело глаза для направленного воздействия на ганглионарные клетки сетчатки. Для введения веществ в зрительный нерв используют либо Gelfoam, либо шприцы Hamilton. Результаты визуализации культи указывают на то, что доставка антиапоптотических факторов может повысить выживаемость ганглионарных клеток сетчатки.

Используя эти методы, данный подход можно применять для идентификации белков, участвующих в апоптозе взрослых нейронов центральной нервной системы. Значение этой методики распространяется на терапию или диагностику заболеваний центральной нервной системы, поскольку перерезка зрительного нерва является воспроизводимой моделью апоптоза нейронов в ЦНС взрослых особей. Как правило, новички в этой технике сталкиваются с трудностями из-за повреждения хрусталика при введении стеклянной пипетки в стекловидное тело глаза. Чтобы подготовить систему шприца для внутриглазных инъекций, начните с извлечения любой иглы или гайки RN.

Возьмите шприц Hamilton 1701 объемом 10 µL с плотно пригнанным поршнем. Вставьте феррулу из PFA в конусную часть зажимного фитинга. Затем вставьте собранный фитинг в конец шприца и слегка закрутите гайку RN сверху.

Вставьте один конец трубки PEEK диаметром 1/16 дюйма в компрессионный фитинг через отверстие в гайке RN. Убедитесь, что трубка PEEK полностью зафиксирована. Затяните гайку RN, чтобы сжать феррулу, которая обеспечит герметичность соединения трубки PEEK.

Повторите этот процесс с обоих концов двойного стеклянного соединителя RN. Присоедините свободный конец трубки пика к одному концу двойного стеклянного соединителя RN, затянув фиксирующую гайку RN. Стеклянная микропипетка будет служить иглой и цилиндром системы для инъекций.

Вставьте стеклянную пипетку в свободный конец двойного стеклянного соединителя RN. Затяните гайку RN, чтобы зафиксировать пипетку. Под диссекционным микроскопом сформируйте кончик подходящего диаметра, удерживая вытянутую микропипетку под углом и протирая ее кончик о матовое стекло предметного стекла до момента скола.

В идеале кончик должен быть слегка скошен. Затем, используя комплект для заполнения от компании Hamilton Syringe Company, заполните шприц, соединитель трубки пика, двойной стеклянный соединитель RN и стеклянную микропипетку минеральным маслом для использования. В гидравлической системе инъекций замените иглу на иглу Hamilton 9 0 0 3 0.

Затем наденьте резиновую перегородку (септум) на иглу Hamilton 9 0 0 3 0, чтобы обеспечить герметичность при введении минерального масла. Вставьте иглу Hamilton 9 0 0 3 0 шприца для заполнения в заднюю часть цилиндра 10 µL шприца Hamilton системы ввода. Плотно прижмите септум к концу шприца для создания герметичного соединения.

Медленно нажмите на плунжер, чтобы минеральное масло прошло через стеклянные элементы системы инъекций, заполняя стеклянную пипетку. Пропустите все масло через систему инъекций, чтобы удалить все пузырьки воздуха из тракта.

Если минеральное масло в шприце для заполнения заканчивается, медленно извлеките иглу, постоянно подавая масло. Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха, повторно наполните подготовительный шприц и проведите инъекцию еще раз. Когда вся система будет заполнена минеральным маслом, вставьте оригинальный поршень от 10 microliter.

Полностью нажмите на поршень шприца Hamilton, чтобы удалить из системы излишки минерального масла. Протрите стеклянную микропипетку и конец шприца до чистоты. С помощью 70% ethanol оттяните поршень до отметки 2 µL на цилиндре.

Кончик стеклянной микропипетки заполнится воздухом, что создаст буферную зону между минеральным маслом и вводимым раствором. Заполните корпус пипетки, поместив ее кончик в необходимый раствор и выдвинув плунжер шприца Hamilton. Для выполнения интраокулярной инъекции в глаз взрослой крысы вводится не более 4–5 µL раствора.

Начните с переключения потока газа на насадку газовой маски стереотаксической рамы. Затем поместите крысу, находящуюся под воздействием изофлурана, в стереотаксический аппарат. Снизьте концентрацию изофлурана до 2% и контролируйте глубину анестезии.

Накройте животное хирургическим одеялом. Для поддержания температуры тела на протяжении всей операции откройте веки и закапайте одну каплю раствора анестетика на поверхность роговицы. Для проведения инъекции требуются два человека: один для введения стеклянной пипетки в стекловидную полость и удержания её в заданном положении.

И еще одну, чтобы нажать на поршень шприца, который подает необходимый раствор. Под хирургическим микроскопом захватите стеклянную микропипетку и двойной стеклянный соединитель RN, раздвиньте веки, образовав V-образную форму напротив места инъекции; при этом пальцами приподнимите глаз из орбиты. Осторожно введите кончик стеклянной микропипетки в область, не имеющую кровеносных сосудов, и через склеру под наклоном вниз.

Когда пипетка проникает сквозь склеру, будет ощущаться легкий щелчок. Лицо, удерживающее шприц, должно ввести 4 µL раствора, нажав на поршень до отметки 2 µL на шприце. Введение должно занять примерно от одной до двух секунд.

После успешного введения раствор промоет стекловидную полость; удерживайте микропипетку неподвижно в течение примерно пяти секунд, затем извлеките ее в том же направлении, в котором вводилась игла. Конъюнктива закроет небольшое отверстие, что поможет уплотнить прокол склеры. По завершении операции выключите изофлуран и дайте животному подышать кислородом в течение нескольких минут. Нанесите на поверхность роговицы офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить пересыхание роговицы во время восстановления, затем снимите животное со стереотаксического устройства и верните его в клетку для восстановления.

Для манипуляций с ганглиозными клетками сетчатки посредством ретроградного транспорта после экзотомии сначала выполните пересечение зрительного нерва согласно инструкциям в сопроводительном видео «Протокол пересечения зрительного нерва», 2, 2 4, 1 трассеры, препараты. Плазмиды, сиРНК или вирусные векторы можно наносить на культю зрительного нерва.

Существует два основных метода выполнения данной процедуры: с использованием гельфоама или путем прямой инъекции в зрительный нерв. При использовании метода с гельфоамом необходимо убедиться, что ганглионарные клетки сетчатки были предварительно маркированы путем введения ретроградных трейсеров в верхний холмик за одну неделю до проведения таксономии. Сразу после перерезания зрительного нерва поместите небольшой кусочек гельфоама, пропитанного экспериментальным раствором, на срез зрительного нерва, после чего содержимое орбиты возвращают в исходное положение.

Когда глаз возвращен в нейтральное положение, с помощью пинцета протолкните фрагмент желатиновой губки в орбиту, убедившись, что он перекрывает конец зрительного нерва. Метод инъекции более эффективен для доставки веществ, которые должны проникнуть в цитоплазму аксона для последующего ретроградного транспорта с током цитоплазмы. Для введения необходимого раствора в пересеченный зрительный нерв используется герметичный шприц Hamilton объемом 10 µL. Рекомендуется использовать иглу с коротким срезом.

Наберите в шприц 10 µL раствора для инъекции. Обычно для инъекций используют плазмиды irna или вирусные векторы. Захватите край зрительного нерва тонким пинцетом Dumont. Введите кончик иглы в зрительный нерв параллельно нерву.

Вводите иглу до тех пор, пока ее срез не скроется из виду; в этот момент игла будет полностью окружена нервом со всех сторон. После введения иглы осторожно сожмите края нерва тонкоконечными пинцетом и введите одну четверть раствора, вращая шприц. Поверните шприц на одну четверть оборота по часовой или против часовой стрелки.

Повторяйте эти действия до тех пор, пока игла не совершит полный оборот и все содержимое шприца не будет введено. Извлеките кончик шприца из нерва. Оставьте любую введенную жидкость, которая вытекла из нерва в орбиту, так как она создаст дополнительный резервуар для поглощения концами аксонов.

Верните содержимое орбиты в исходное положение, зашейте рану и дайте животному восстановиться. После операции животные должны содержаться раздельно. Послеоперационные анальгетики следует вводить в соответствии с рекомендациями вашего комитета по уходу за животными.

За состоянием животных и их общим самочувствием следует тщательно наблюдать после операции. Как показано в данном видео, воздействие на RGC можно осуществлять путем введения пептидов, лекарственных препаратов, векторов, плазмид или siRNAs непосредственно в культю пересеченного зрительного нерва. В данном репрезентативном примере было выполнено ретроградное мечение fluoro gold, после чего в зрительный нерв были незамедлительно введены меченные SI three пептиды.

Затем была проведена прижизненная визуализация сетчатки, чтобы предотвратить вымывание пептидов из ткани во время фиксации; как видно здесь, меченные SI3 пептиды, введенные в зрительный нерв, подверглись ретроградному транспорту обратно в сомы ганглионарных клеток сетчатки (ГКС) в сетчатке. В данном примере в культю зрительного невра были введены меченные SI3 siRNA. Сразу после таксотомии была снова проведена прижизненная визуализация сетчатки; меченные SI3 siRNA, введенные в зрительный нерв, были транспортированы ретроградно ГКС, о чем свидетельствует их колокализация.

При использовании ретроградного мечения FluoroGold эта методика, после того как она будет освоена, может быть выполнена за считанные секунды при правильном подходе. При выполнении данной процедуры крайне важно проявлять осторожность, чтобы не повредить хрусталик. Не забывайте, что работа с вирусными частицами может быть чрезвычайно опасной, поэтому при выполнении этой процедуры необходимо всегда соблюдать требования учреждения по работе с биологическими опасностями.