Методы экспериментальных манипуляций после оптические Перерезка нерва в ЦНС млекопитающих

Ганглиозные клетки сетчатки или RG cs — это нейроны центральной нервной системы, которые передают визуальную информацию от сетчатки к мозгу через зрительный нерв. В сопутствующем видео был продемонстрирован метод содомизации или разрезания аксонов всей популяции РГК в качестве модели гибели апоптотических нервных клеток в центральной нервной системе взрослого человека. В данном случае этот метод сочетается с процедурами, которые непосредственно нацелены на нейротрофические факторы, короткие интерферирующие РНК, плазмиды или вирусные векторы, которые кодируют анти-ATO белки к поврежденным ганглиозным клеткам сетчатки или сетчатке для глобального воздействия на сетчатку.

Аппарат для внутриглазных инъекций собирается и используется для введения веществ в стекловидное тело глаза, чтобы целенаправленно нацелиться на ганглиозные клетки сетчатки. Либо устанавливается гельпена, либо используются шприцы Гамильтона для введения веществ в зрительный нерв. Результаты визуализации культи показывают, что выживаемость ганглиозных клеток сетчатки может быть увеличена за счет доставки антиапоптотических факторов.

Используя эти методы, этот метод может быть использован для идентификации белков, которые участвуют в апоптозе взрослых нейронов в центральной нервной системе. Применение этого метода распространяется на терапию или диагностику заболеваний центральной нервной системы, потому что пересечение зрительного нерва является воспроизводимой моделью апоптоза нейронов в ЦНС взрослого человека. Подготовка шприцевой системы к внутриглазным инъекциям начинается с удаления любой иглы или гайки РН.

Присутствует на 10 микролитре рн туго 1701 Hamilton. Вставьте PFA feral в пиковую чашечку feral компрессионного фитинга. Затем вставьте готовый фитинг в конец шприца и неплотно закрутите гайку RN сверху.

Вставьте один конец одной 16-дюймовой трубки с козырьком в компрессионный фитинг через отверстие в гайке RN. Убедитесь, что пиковая трубка полностью установлена. Затяните гайку RN, чтобы сжать фералу, что приведет к герметизации трубки пика.

Повторите этот процесс на обоих концах двойной стеклянной муфты RN. Прикрепите свободный конец пиковой трубки к одному концу двойной стеклянной муфты RN, затянув упор гайки RN. Стеклянная микропипетка образует иглу и цилиндр для системы инъекций.

Вставьте стеклянный дозатор в свободный конец стеклянной муфты с двойным RN. Затяните гайку RN, чтобы зафиксировать пипетку на месте. Под препарирующим микроскопом создайте наконечник соответствующего диаметра, держа вытянутую микропипетку под углом и потирая наконечник по стеклянной глазури предметного стекла для создания излома.

В идеале конечный кончик должен быть слегка скошен. Затем используйте набор для грунтовки от компании Hamilton Syringe, наполненный шприцем, линкером для пиковых трубок, двойным стеклянным соединителем RN и стеклянной микропипеткой с минеральным маслом для использования. С помощью гидравлической системы впрыска замените иглу на иглу Hamilton 9 0 0 3 0.

Затем наложите резиновую перегородку на иглу Hamilton 9 0 0 3 0, чтобы обеспечить герметичность при впрыске минерального масла. Вставьте иглу Hamilton 9 0 0 3 0 грунтовочного шприца в заднюю часть ствола шприца Hamilton объемом 10 микролитров системы для инъекций. Плотно прижмите перегородку к концу шприца, чтобы создать уплотнение.

При медленном нажатии на поршень минеральное масло пройдет через стеклянные элементы системы впрыска. Заполнение стеклянной пипетки. Протолкните все масло через систему впрыска, чтобы удалить пузырьки воздуха вдоль тракта.

Если в наполняющем шприце заканчивается минеральное масло, медленно извлеките иглу, постоянно выдавая масло. Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха, наполните грунтовочный шприц и введите его снова. Когда вся система будет заполнена минеральным маслом, вставьте оригинальный поршень объемом 10 микролитров.

Шприц Hamilton полностью надавливает на поршень, чтобы удалить лишнее минеральное масло из системы. Протрите стеклянную микропипетку и конец шприца начисто. С 70% этанолом выведите поршень до отметки в два микролитра на бочке.

Конец стеклянной микропипетки будет заполнен воздухом, обеспечивая буферную зону между минеральным маслом и жидкостью, которую необходимо впрыснуть. Наполните цилиндр пипетки, поместив конец микропипетки в нужный раствор и вытащив поршень шприца Hamilton. Для проведения внутриглазной инъекции взрослой крысе в глаз будет введено не более четырех-пяти микролитров раствора.

Начните с переключения потока газа на крепление противогаза для стереотаксической рамы. Затем поместите крысу под наркозом изоофа под наркозом в стереотаксический аппарат. Уменьшите концентрацию изофа фтора до 2% и контролируйте анестезию.

Накройте животное хирургическим одеялом. Чтобы поддерживать температуру тела на протяжении всей операции, откройте веки и капните одну каплю раствора анестетика акана. На поверхность роговицы инъекции требуются два человека, один из которых вводит стеклянную пипетку в стекловидную камеру и поддерживает положение пипетки.

А еще один надавить на поршень на шприц, который выдает нужный раствор. Под хирургическим микроскопом возьмитесь за стеклянную микропипетку и двойную стеклянную муфту RN, раздвиньте веки, образуя V-образную форму напротив места инъекции. Аккуратно введите кончик стеклянной микропипетки через область, лишенную кровеносных сосудов, и через склеру под углом вниз.

Когда пипетка проникнет в склеру, будет ощущаться небольшой хлопок. Теперь человек, держащий шприц, должен ввести четыре микролитра раствора, нажав на поршень до отметки в два микролитра на шприце. Инъекция должна занять примерно одну-две секунды.

Успешно введенный раствор будет промываться через камеру стекловидного тела, удерживать микропипетку в неподвижном положении в течение примерно пяти секунд, а затем выводиться в том же направлении. После завершения операции выключите изофтор и дайте животному дышать кислородом в течение нескольких минут. Покройте поверхность роговицы офтальмологической глазной мазью Чтобы предотвратить высыхание роговицы во время восстановления, затем извлеките животное из стереотаксического устройства и верните его в клетку для восстановления.

Манипулировать ганглиозными клетками сетчатки посредством ретроградного транспорта после экс-отомии. Сначала выполните пересечение зрительного нерва в соответствии с инструкцией в сопутствующем видео протокол пересечения зрительного нерва, 2, 2, 4, 1 индикаторы лекарственных препаратов. Плазмиды, миРНК или вирусные векторы могут быть нанесены на культю зрительного нерва.

Существует два основных метода выполнения этой процедуры с помощью гелевой пены или прямого введения в зрительный нерв. Если используется метод гелевой пены, убедитесь, что ганглиозные клетки сетчатки были предварительно помечены, путем введения ретроградных индикаторов в верхний холмик за неделю до таксономии. Сразу после того, как зрительный нерв перерезан, на пересеченную культю зрительного нерва помещают небольшой кусочек гелевой пены, смоченной в экспериментальном растворе, затем содержимое орбиты возвращают на прежнее место.

Когда глаз вернется в нейтральное положение, с помощью щипцов протолкните кусочек гелевой пены вниз в орбиту, следя за тем, чтобы он оставался над концом зрительного нерва. Техника инъекции более эффективна для доставки веществ, которые должны получить доступ к цитоплазме аксона, чтобы быть сильно транспортируемыми оп плазменным потоком, используется газоплотный шприц Гамильтона объемом 10 микролитров для введения нужного раствора в пересеченный зрительный нерв. Желательна игла с коротким скосом.

Загрузите в шприц 10 микролитров раствора, который будет вводиться. Как правило, ирнк-плазмиды или вирусные векторы для инъекции захватывают край зрительного нерва с помощью щипцов Дюмона с тонким концом. Введите конец иглы в зрительный нерв, параллельно нерву.

До тех пор, пока фаска не станет заметной, введенная игла будет окружена со всех сторон нервом. После того, как игла введена, осторожно сожмите стороны нерва с помощью щипцов с тонким концом и введите одну четверть раствора, вращая шприц. Одну четверть повернуть по часовой стрелке или против часовой стрелки.

Продолжайте повторять эти шаги до тех пор, пока не будет завершен полный оборот иглы и не будет введено все содержимое шприца. Извлеките кончик шприца из нерва. Оставьте любую введенную жидкость, которая имеет рефлюкс от нерва, внутри орбиты, так как это сформирует дополнительный бассейн для поглощения концами аксонов.

Верните содержимое орбиты в исходное положение, закройте рану и дайте животному восстановиться. После операции животные должны содержаться самостоятельно. Послеоперационные анальгетики следует вводить в соответствии с рекомендациями по уходу за животными.

Органы власти и животные должны находиться под тщательным наблюдением после операции. Как показано в этом видео, РГК может быть прямым воздействием путем доставки пептидов, лекарств, векторов, плазмид или миРНК к пересеченной культе зрительного нерва. В этом репрезентативном примере было выполнено ретроградное мечение флюорозолотидом и три меченых пептида SI были немедленно введены в зрительный нерв.

Затем была выполнена живая визуализация сетчатки, чтобы предотвратить вымывание пептидов из ткани во время фиксации, как можно видеть здесь, три меченых пептида, введенные в зрительный нерв, были ретро, в значительной степени транспортировались обратно в сомато RGC в сетчатке. В этом примере три меченые миРНК SI были введены в культю зрительного нерва. Сразу после повторного выполнения таксотомии и визуализации сетчатки в реальном времени, три меченые миРНК SI, введенные в зрительный нерв, были ретроградными, транспортируемыми RG CS, о чем свидетельствует их колокализация.

С помощью ретроградного мечения флюозолдом После освоения этой техники можно выполнить за считанные секунды, если все сделано правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно соблюдать осторожность, чтобы не повредить линзу. Не забывайте, что работа с вирусными частицами может быть крайне опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует руководствоваться институциональными рекомендациями по работе с биологическими опасностями.