Высокое разрешение Волоконно-оптические Microendoscopy для На месте Сотовые изображений

Традиционно биологические и клинические исследования, требующие микроскопического анализа с клеточным разрешением, проводились путем параллельного выполнения нескольких экспериментов, при которых отдельные образцы изымались из исследования в последовательные моменты времени для оценки с помощью световой микроскопии, в то время как конфокальная, многофотонная микроскопия и микроскопия второго гармонического генерания являются полезными методами визуализации in situ. Необходимая инфраструктура сложна и дорога, так как включает сканирующие лазерные системы и сложные источники света. В данной работе мы демонстрируем, как за один день собрать систему волоконно-оптического микроэндоскопа высокого разрешения, используя готовые коммерческие компоненты стоимостью менее 5 000 долларов США.

Платформа обеспечивает гибкость в выборе разрешения изображения, поля зрения и рабочей длины волны. Сначала собирается простой корпус эпифлуоресцентного микроскопа, в который устанавливаются источник света, оптические фильтры, линзы, волоконно-оптический жгут и CCD-камера. Затем устанавливаются линзы для визуализации, которые формируют увеличенное изображение волоконно-оптического жгута на CCD-камере.

Затем устанавливается светодиодный (LED) источник с осветительной оптикой для обеспечения возбуждающего флуоресцентного света, направленного на образец. В итоге с помощью собранного микроэндоскопа в режиме реального времени визуализируются детали клеточного уровня флуоресцентно меченых образцов, включая культуры in vitro, животных модели in vivo и людей. Основным преимуществом этого метода по сравнению с существующими, такими как конфокальная или мультифотонная микроскопия, является его достаточная простота и доступность, что позволяет исследователям из самых разных областей быстро внедрить его и адаптировать под свои конкретные задачи.

Описанный здесь микроэндоскоп высокого разрешения следует рассматривать как базовую конфигурацию, допускающую несколько вариантов сборки и применения. При выборе компонентов для конкретной задачи учитывайте взаимосвязи, характерные для флуоресцентной микроскопии, между концентрацией флуорофора, освещением, вызывающим фотообесцвечивание, интенсивностью, чувствительностью камеры, усилением и временем экспозиции. Данная платформа предназначена для использования с профлавином в качестве флуоресцентного контрастного агента, но может быть сконфигурирована для работы с другими флуоресцентными красителями.

Pro flavin представляет собой яркий краситель для ядер с пиками поглощения и испускания на длинах волн 445 нм и 515 нм соответственно. При использовании других контрастных веществ пользователю потребуется соответствующим образом подобрать фильтры возбуждения, испускания и дихроичные фильтры для сборки системы микроэндоскопа. Начните с соединения двух шестидюймовых стержней каркасной системы с двумя 1,5-дюймовыми стержнями, чтобы получить пару стержней длиной 7,5 дюймов. Вкрутите стержни в одну из граней блока складного зеркала, затем установите зеркало диаметром один дюйм.

Затем вкрутите четыре стержня длиной 0.5 inch в противоположную грань блока складного зеркала. Наденьте куб клетки на стержни клетки длиной 7.5 inch через два нижних сквозных отверстия. Вкрутите стержни длиной two inch в боковую грань куба клетки.

Используя адаптер с креплением C-mount на SM1, закрепите камеру на платформе каркаса. Зафиксируйте платформу на каркасных стержнях диаметром 0,5 inch вровень с передней панелью блока складного зеркала. Выберите тубусный объектив диаметром one inch для формирования изображения волоконно-оптического пучка на камере.

Фокусное расстояние линзы следует выбрать таким образом, чтобы область волоконно-оптического пучка охватывалась как минимум двумя пикселями. При установке изображения на камеру вставьте линзу в линзовую трубку длиной три дюйма и закрепите ее стопорным кольцом. Для вкручивания стопорных колец в длинные линзовые трубки удобно использовать разводной ключ.

Поместите эмиссионный фильтр в трехдюймовую линзовую трубку поверх первого стопорного кольца и установите еще одно кольцо, чтобы зафиксировать фильтр на месте. Убедитесь, что ориентация фильтра соответствует спецификациям производителя. Вкрутите линзовую трубку в боковую грань куба-корпуса, ближайшую к CCD-камере.

Это положение также показано здесь. Обратите внимание, что на схеме эта линза и фильтр изображены без трехдюймовой линзовой трубки. Для большей наглядности подключите камеру к компьютеру и просматривайте изображение на экране.

Направьте сборку в клетке на удаленный объект и перемещайте куб клетки вдоль направляющих до тех пор, пока изображение объекта не станет четким. С помощью отвертки затяните четыре винта, расположенные по бокам куба клетки. При затягивании эти винты фиксируют направляющие, удерживая куб в заданном положении.

Это обеспечит формирование тубус-линзой сфокусированного изображения пучка волокон на камере при использовании объектива с поправкой на бесконечность. Затем вставьте дихроичное зеркало в держатель и установите его под углом 45 градусов в куб клетки. Прикрутите объектив к грани куба клетки, противоположной держателю тубус-линзы, с помощью переходника с резьбы RMS на SM1 и регулируемой линзовой трубки.

После этого вкрутите SMA-разъем в пластину каркаса и закрепите ее на стержнях примерно на рабочем расстоянии объектива. Установите базовую пластину и концевую заглушку с открытых сторон каркасного куба. Затем закрепите светодиод на пластине каркаса и задвиньте ее на конец двухдюймовых стержней.

Установите линзу в линзовую трубку диаметром 0,5 дюйма таким образом, чтобы при ввинчивании этой трубки в боковую грань куба системы cage формировалось изображение светодиода, заполняющее заднюю апертуру объектива. Также установите возбуждающий фильтр в линзовую трубку. На данном этапе для управления интенсивностью освещения с помощью эпоксидного клея можно использовать драйвер светодиода.

Присоедините SMA-коннектор для волокна диаметром 1030 мкм к волоконно-оптическому жгуту с полем зрения 720 мкм. Подробную информацию по установке разъемов волоконной оптики см. в руководстве Thorlabs (артикул FN 96) «Руководство по установке разъемов и полировке оптических волокон».

Вкрутите пучок с разъемами SMA в SMA-гнездо, установленное на стержнях каркаса; направьте дистальный конец пучка в сторону широкополосного источника света (подойдет флуоресцентное освещение). Затем рассмотрите изображение проксимального торца пучка на CCD-камере. В завершение отрегулируйте положение объектива, вкручивая или выкручивая его из куба каркаса.

До того как изображение пучка волокон станет четким, отдельный канал должен быть отчетливо виден. Пространственное разрешение микроэндоскопа можно увеличить, закрепив микролинзу или систему линз на дистальном конце пучка волокон. Данная оптика сконфигурирована таким образом, что вместо непосредственного прикладывания конца пучка к ткани, изображение конца проецируется на поверхность ткани с определенным увеличением.

Тем самым увеличивается частота пространственной дискретизации, обусловленная световодными свойствами волоконного пучка. Степень увеличения dem соответствует повышению пространственного разрешения и, в то же время, пропорциональному уменьшению поля зрения. Выберите GRIN-линзу с необходимым увеличением и рабочим расстоянием для вашего применения.

Убедитесь, что диаметр линзы соответствует диаметру используемого пучка волокон. Установите пучок волокон и GRIN-линзу на отдельные трехкоординатные ручные позиционеры под микроскопом с малым увеличением или стереомикроскопом для точного совмещения.

Затем нанесите каплю оптического клея либо на линзу, либо на торец пучка. С помощью ручных позиционеров приведите два компонента в соприкосновение. Облучайте интерфейс ультрафиолетовым светом в течение дозы, рекомендованной производителем, для полимеризации клея.

Чтобы защитить градиентную линзу и склеенный интерфейс, используйте короткий отрезок алюминиевой капиллярной трубки для закрытия стыка. Наденьте трубку на стык и зафиксируйте ее, нанеся каплю эпоксидного клея на каждый конец трубки; для завершения сборки используйте термоусадочную трубку. Перед проведением микроэндоскопической визуализации нанесите контрастное вещество на клетки или ткань, предназначенные для исследования, чтобы визуализировать клетки и культуру.

Сначала удалите питательную среду с помощью пипетки. Затем осторожно внесите раствор профлавина в лунку с помощью пипетирования. После короткой инкубации продолжительностью до одной минуты удалите раствор профлавина пипеткой и утилизируйте его.

Промойте клетки, добавив и затем удалив из лунки свежий раствор PBS. Для обеспечения стабильности закрепите дистальный конец пучка волокон в надежном фиксаторе с ручными позиционирующими столиками по осям x, Y, Z. Во время визуализации, после нанесения красителя на клетки или ткань, приложите волоконно-оптический пучок к образцу легким касанием. Просматривайте изображение с волоконно-оптического пучка на экране компьютера, используя либо программное обеспечение от производителя камеры, либо любое специализированное ПО, которое вы пожелаете разработать.

Отрегулируйте время экспозиции и усиление камеры, чтобы получить изображение приемлемой яркости. При правильной сборке микроэндоскоп будет работать как эпифлуоресцентный микроскоп с передачей изображения через когерентный волоконно-оптический пучок. Для достижения оптимальных результатов визуализации необходимо убедиться в соблюдении трех ключевых условий.

Сначала проксимальный торец пучка волокон следует проецировать на ПЗС-камеру без расфокусировки для достижения максимального разрешения системы. Здесь представлено изображение части пучка волокон при плохой фокусировке, частичной фокусировке и хорошей фокусировке. Оптимальный фокус достигается путем регулировки фактического положения объектива относительно торца пучка.

Во-вторых, проксимальный торец пучка волокон должен быть равномерно освещен по всему его диаметру. Как было описано ранее, это достигается путем настройки оптики освещения для коллимированного освещения. Изображение, представленное здесь, было получено при освещении однородного флуоресцентного образца в этой предпочтительной конфигурации.

Здесь показан соответствующий результат при критическом освещении. Структура светодиода проецируется на торец пучка волокон, в результате чего возникает этот нежелательный узор, наложенный на истинную структуру образца. В-третьих, важно убедиться, что и проксимальный, и дистальный торцы пучка волокон чисты, не имеют царапин и сколов.

В данном примере на торце пучка видны загрязнения, а по периметру волокна в положении «на пять часов» заметно повреждение в виде небольшого скола. Загрязнения с торцов пучка можно удалить, очистив их аналогично обычным волоконно-оптическим разъемам с помощью линзовой бумаги и изопропанола или стандартных инструментов для очистки волоконной оптики. 1483 клетки были помечены профлавином, после чего пучок с открытыми волокнами аккуратно поместили на образец.

Здесь представлена визуализация in vitro: при прикреплении GRIN-линзы с увеличением 2,5х к концу пучка было достигнуто повышение пространственного разрешения и уменьшение поля зрения. Визуализация in vivo, в которой оптоволоконный пучок с внешним диаметром 0,5 мм был проведен через иглу 21-го калибра и введен в ткань жировой подушки молочной железы мыши, выполнена так, как показано в этом видео; четко видны адипоциты с перемещением, обусловленным сердечным циклом. В данном примере визуализация слизистой оболочки полости рта здорового добровольца была проведена с использованием более крупного оптоволоконного пучка с внешним диаметром 1,5 мм.

Во всех примерах в качестве флуоресцентного контрастного агента для маркировки ядер использовался pro flavin. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как спроектировать и собрать волоконно-оптический микроэндоскоп для двухфотонной флуоресцентной визуализации клеток и тканей.