JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 1:30 мин • March 4th, 2025
Начните с предварительно зафиксированного, депарафинизированного и регидратированного коронального среза мозга, содержащего нейроны, подвергающиеся апоптозу, характеризующемуся гибелью клеток и фрагментацией ДНК.
Чтобы обнаружить апоптотическую гибель клеток с помощью анализа TUNEL, обработайте срез мозга ферментом протеиназа-К.
Протеиназа-К проникает в нейроны и инактивирует ДНКазы, предотвращая деградацию ДНК.
Промойте ломтик, чтобы удалить остатки ферментов.
Добавьте буфер, содержащий меченные флуоресцентными красителями дезоксиуридинтрифосфаты, или dUTP, и концевую дезоксинуклеотидилтрансферазу, или фермент TdT, затем инкубируйте.
В апоптотических нейронах с большим количеством фрагментов ДНК фермент TdT прикрепляет эти флуоресцентные dUTP к свободным 3'-гидроксильным группам фрагментов ДНК.
Напротив, ДНК здоровых нейронов остается непомеченной.
Окрасьте ткань DAPI, ядерным красителем, который связывается с ДНК как здоровых, так и апоптотических нейронов, окрашивая их ядра в синий цвет.
При визуализации нейроны, содержащие как синюю, так и зеленую флуоресценцию, подтверждают гибель апоптотических клеток в тканях мозга.