Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 1:30 мин. • March 4th, 2025
Начнем с белков спинномозговой жидкости, включая фосфорилированный альфа-синуклеин, биомаркер нейродегенеративных заболеваний.
Добавьте загрузочный буфер, содержащий моющее средство, восстановитель и краситель для слежения.
Нагрейте, чтобы денатурировать белки, затем загрузите их в гель SDS-PAGE.
Проведите электрофорез для разделения белков по молекулярной массе на отдельные полосы.
Инкубируйте гель в промокательном буфере с перемешиванием.
Затем электропереносите белковые полосы из геля на мембрану.
Обработайте мембрану фиксатором для удержания белка на мембране, затем промойте.
Инкубируйте с блокирующим раствором, содержащим первичные антитела и ингибиторы фосфатазы, для поддержания фосфорилирования альфа-синуклеина.
Антитела взаимодействуют исключительно с фосфорилированным альфа-синуклеином, а блокирующие реагенты блокируют неспецифические сайты взаимодействия, затем промываются.
Введите конъюгированные с ферментом вторичные антитела, которые взаимодействуют с первичными антителами, затем промойте.
Добавьте хемилюминесцентный субстрат, взаимодействуя с ферментами и генерируя хемилюминесценцию.
Хемилюминесцентная полоса подтверждает наличие фосфорилированного альфа-синуклеина.