JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 1:22 мин • March 4th, 2025
Возьмем гомогенат ткани мозга млекопитающих, который содержит как нормальные прионные белки, так и неправильно свернутые прионные агрегаты, ответственные за нейродегенеративные заболевания.
Инкубируйте с протеолитическим ферментом, чтобы переварить нормальные прионы, оставляя устойчивые агрегаты нетронутыми.
Обработайте агрегаты денатурирующим буфером при высокой температуре, чтобы линеаризировать белки и придать им равномерный отрицательный заряд.
Загрузите образец на гель для электрофореза и разделите белки на полосы, что подтверждает наличие агрегатов.
С помощью электрического поля перенести разделенные белки на мембрану.
Инкубируйте мембрану в блокирующем растворе, чтобы замаскировать неспецифические участки связывания.
Инкубируйте с антителами, меченными ферментом пероксидаза, которые специфически связываются с агрегатами прионов.
Промойте мембрану, чтобы удалить несвязанные антитела, минимизировав неспецифические сигналы.
Добавьте хемилюминесцентную подложку и окислитель, что позволит пероксидазе окислять подложку и производить свет.
Измерьте интенсивность света, чтобы количественно определить неправильно свернутые прионы в гомогенате.