JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 1:22 мин • March 4th, 2025
Начните с ткани человеческого мозга в буфере для лизиса.
Гомогенизируйте ткань с помощью гомогенизатора, чтобы высвободить белки, включая декарбоксилазу глутаминовой кислоты или изоформы фермента GAD, необходимые для работы мозга.
Инкубируйте гомогенат на льду, затем центрифугируйте для гранулирования мусора. Соберите белковосодержащую надосадочную жидкость.
Добавьте загрузочный буфер, содержащий моющее средство и восстановитель для денатурации белков.
Загрузите этот образец и молекулярный маркер на градиентный гель SDS-PAGE и электрофорез, чтобы разделить белки на отдельные полосы.
Электропромокните белки геля на мембранном листе.
Добавьте блокирующий агент для предотвращения неспецифической привязки.
Инкубируйте с GAD-изоформ-специфичными первичными антителами, которые связываются со своими рецептивными изоформами GAD.
Промойте, чтобы удалить несвязанные антитела.
Инкубируйте с флуоресцентно меченными вторичными антителами.
Снова промойте и визуализируйте белковые полосы на системе визуализации.
Определите полосы GAD с помощью флуоресценции и подтвердите их различия в молекулярной массе с помощью маркера.