Парные Patch Clamp Recordings от Мотор-нейрон и целевые скелетных мышц в данио рерио

Общая цель данной процедуры заключается в получении одновременных электрофизиологических записей потенциала действия моторного нейрона и связанного с ним синаптического ответа в целевой мышце. Это достигается путем первоначального удаления кожи с верхней стороны рыбы. Вторым этапом процедуры является обнажение спинного мозга путем удаления всех вышележащих клеток дорсальной мускулатуры.

Третьим этапом процедуры является обнажение целевой быстрой мышцы путем удаления верхнего слоя медленной мышцы. Заключительный этап процедуры заключается в применении метода фиксации тока (current clamp) для первичного нейрона или нейрона капюшона и метода фиксации потенциала (voltage clamp) для целевой скелетной мышцы. В конечном итоге можно получить результаты, демонстрирующие синаптические ответы в мышце, связанные с генерацией потенциалов действия двигательного нейрона, путем одновременной фиксации тока двигательного нейрона и фиксации потенциала целевой мышцы.

Линия Super Fish обладает сочетанием преимуществ: она облегчает регистрацию пар «двигательный нейрон — скелетная мышца», малый размер мышцы позволяет эффективно использовать метод фиксации потенциала (voltage clamp), а стереотипные особенности головного двигательного нейрона позволяют легко идентифицировать его и получить к нему доступ. Теперь я пошагово разберу процедуры, необходимые для установки патч-кламп как для нейрона, так и для мышцы. Перед началом процедуры приготовьте пять основных растворов, которые включают: базовый раствор (Bath solution), базовый раствор с Trica, базовый раствор с IDE, внутренний раствор для нейрона и внутренний раствор для мышцы.

Затем выберите одну личинку данио-рерио в возрасте от 72 до 96 часов и поместите ее в ванночный раствор с трикаином. В течение одной минуты после воздействия анестетика рыба перестанет реагировать. Чтобы проверить потерю чувствительности, перенесите рыбу на пластичную чашку и, используя стереомикроскоп, проведите декапитацию с помощью двустороннего лезвия бритвы.

Перенесите рыбу в стеклянную записывающую камеру, покрытую сардом и заполненную раствором Басса. С помощью булавки создайте кожный лоскут у рострального конца рыбы, чтобы обеспечить надежный захват тонким пинцетом. Удалите вышележащую кожу, захватив ее тонким пинцетом рядом с ростральной булавкой.

Медленно снимите кожу, осторожно оттягивая ее в направлении хвоста. Обработайте рыбу 3 mL раствора для ванны с формальдегидом в течение 3–5 минут, чтобы заблокировать мышечные сокращения, которые могут помешать регистрации данных. Промойте пять раз обычным раствором для ванны.

Удалите часть поверхностного слоя мышц в области пяти-шести сегментов, осторожно соскребая ее боковой стороной вольфрамовой иглы. Перенесите рыбу под вертикальный микроскоп, помещенный в клетку Фарадея для защиты от электрических помех. Микроскоп оснащен фиксированным предметным столиком с большим рабочим расстоянием, объективом 40 x и зумом от 0,5 до четырех x.

Микроскоп установлен на моторизованном XY-переводном столике. Для перемещения препарата между нервом и мышцей при большом увеличении использование оптики дифференциального интерференционного контраста помогает визуализировать нейроны при зуме 0,5x. Используйте пипетку с широким отверстием 15 мкм, чтобы удалить вышележащую мышечную ткань и обнажить спинной мозг.

Отрицательное давление создается с помощью одноразового шприца объемом 3 cc, и мышечные клетки удаляются по одной. Эту процедуру повторяют для пяти-шести дорсальных сегментов скелетных мышц. С помощью той же широкой пипетки удаляют два верхних слоя вентральной мышцы для получения целевых быстрых скелетных мышц.

На этом подготовка к парным записям завершена, и увеличение микроскопа установлено примерно на 1.6 x. Чистые сегменты сканируют для поиска нейронов шапочки. Каждый HEMI-сегмент спинного мозга содержит один крупный мотонейрон шапочки диаметром 10 микрон.

Это тело нейрона каплевидной формы расположено поверхностно под спинальной Jira, рядом с самым каудальным концом сегментарной границы. Выбирается один нейрон для регистрации, после чего сканируется соответствующий каудальный сегмент и вентральное поле целевой мышцы для проверки их целостности. Для записи позиционируются два патч-электрода: один для нейрона, а второй — для мышцы.

Верхний электрод имеет пологий конус для проникновения через плотную твердую мозговую оболочку спинного мозга, а отверстие его кончика составляет примерно два микрона. Нижний электрод имеет более крутой конус для регистрации потенциалов скелетных мышц в режиме фиксации напряжения с низким сопротивлением. Расположите электрод для нейронов под углом примерно 30 градусов, чтобы проникнуть через твердую мозговую оболочку спинного мозга.

Примерно на пол-сегмента ростральнее выбранного нейрона шапки продвигайте электрод с помощью осевого манипулятора, создавая при этом осторожное непрерывное положительное давление примерно 60 millimeters mercury. Когда электрод прорывает твердую мозговую оболочку, нейрон шапки может быть смещен потоком жидкости из электрода, что потребует повторной корректировки фокуса. Когда электрод касается СОМЫ нейрона шапки, положительное давление сбрасывается, что обычно приводит к немедленному образованию гига-уплотнения (giga seal).

Однако в некоторых случаях, когда не удается сформировать плотное соединение, становится необходимым приложить осторожное отрицательное давление. После формирования соединения электродный потенциал корректируют до -80 millivolts, и приложение отрицательного давления вызывает разрыв клеточной мембраны. Для нейрона колпачка характерно входное сопротивление от 140 до 180 mega ohms и потенциал действия с перелетанием выше +40 millivolts.

Это проверяют путем подачи ступеней деполяризации с постепенно увеличивающейся амплитудой в режиме фиксации тока (current clamp) до тех пор, пока не будет вызван потенциал действия. Затем с помощью моторизованного XY-переводчика микроскоп перемещают к вентральной мышце. При большом увеличении из целевого поля выбирают клетку быстрой мышцы.

Мышечный электрод под положительным давлением продвигается к целевой мышечной клетке; при снятии давления формируется гига-опечатывание (giga seal), после чего потенциал электрода устанавливается на уровне -50 мВ для инактивации натриевых каналов. Затем при осторожном всасывании мембрана клетки разрывается. Падение сопротивления до 100–200 МОм и внезапное появление большого емкостного переходного процесса сигнализируют о вхождении в клетку и готовности к проведению теста на пару.

Записывают деполяризацию мотонейрона путем введения порций тока с постепенно увеличивающейся силой до возникновения потенциала действия. В этот момент в мышце должен быть вызван концевой ток; дальнейшая стимуляция мотонейрона с частотой 1 Гц приводит к возникновению концевых токов без сбоев. При увеличении частоты стимуляции до 100 Гц амплитуда концевых токов начинает колебаться, и в течение 10 секунд стимуляции происходит их функциональное истощение.

Как правило, регистрация активности нейрона остается стабильной в течение одного часа, однако состояние мышечных клеток ухудшается, что проявляется в увеличении последовательного сопротивления. В этом случае эксперимент либо прекращается, либо выполняется патч-кламп другой мышечной клетки. Все записи должны быть завершены в течение одного часа.

После освоения техники записи одной пары процедура занимает от одного до полутора часов. Также можно получить одну или две дополнительные пары в соседних сегментах. За типичный день записи обычно получают от двух до трех пар.

Парная регистрация активности двигательных нейронов и скелетных мышц предоставляет уникальную возможность изучить фундаментальные принципы нервно-мышечной передачи. При использовании в сочетании с линиями рыб-мутантов Motility такой подход позволяет точно определить источник нервно-мышечной дисфункции и дает новое представление о механизмах развития таких заболеваний человека, как метастатический синдром.