Decellularization и Recellularization Целых Печень

Общая цель данной процедуры — подготовить децеллюляризированные трансплантаты печени с использованием децеллюляризированного матрикса печени. Это достигается путем предварительного канюлирования донорской печени, после чего орган децеллюляризируют посредством перфузии серией растворов детергентов.

Затем проводят реваскуляризацию децеллюляризированного матрикса печени путем перфузионного введения первичных гепатоцитов взрослых особей. Для культивирования и целлюляризации трансплантата печени используется система перфузии in vitro. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие функцию печени в трансплантатах соответствующего размера in vitro посредством измерения секреции альбумина, мочевины и общих желчных кислот в перфузионной среде.

Основным преимуществом данной методики перед существующими подходами, такими как создание каркасов из синтетических биоматериалов и традиционные методы тканевой инженерии, является, по моему мнению, наличие состава внеклеточного матрикса, специфичного для данной ткани. Перфузионный децеллюляризированный каркас также обладает тканеспецифичной микроархитектурой, в частности сосудистой структурой. Наличие сосудистой структуры позволяет нам более равномерно реинтродуцировать клетки в каркас.

Это также позволяет нам равномерно перфузировать его питательными веществами для повышения выживаемости клеток. Часть протокола, касающаяся замедления, будет продемонстрирована Нимой вместе с постдоком нашей лаборатории. Часть, касающаяся ретикулярности, будет продемонстрирована Габриэлем Прайсом, который также является постдоком.

Ее работа сосредоточена на индустриализации этих трансплантатов. Для проведения перфузионной децеллюляризации начните с извлечения печени крысы путем канюляции воротной вены. Используя катетер 18G, оставьте открытыми нижнюю и верхнюю полые вены. Поддерживайте орган в увлажненном состоянии в фосфатно-солевом буферном растворе (PBS) в чашке Петри диаметром 10 см.

Затем подготовьте перфузионную систему, состоящую из резервуара объемом восемь литров, перистальтического насоса и ловушки для пузырьков. Заполните перфузионную систему фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и поддерживайте работу системы в течение 10 минут. Затем наполните чашку Петри диаметром 10 сантиметров раствором PBS и снизьте скорость потока буфера до 1,2 миллилитров в минуту.

Осторожно перенесите извлеченную печень в чашку Петри с PBS и оставьте для перфузии на ночь. На следующий день проведите перфузию печени 0,01% раствором sodium ESAL sulfate или SDS в дистиллированной воде в течение пяти минут.

Затем снова переключитесь на PBS на один час. Повторите этапы перфузии SDS и PBS еще три раза, увеличивая время перфузии SDS до 10, 15 и, наконец, до 20 минут. Затем проведите перфузию печени следующей серией: 0,01% SDS в течение 24 часов.

0,1% SDS в течение 24 часов. 0,2% SDS в течение трех часов, 0,5% SDS в течение трех часов. Дистиллированная вода в течение 15 минут, 1% Triton X 100 в дистиллированной воде в течение 30 минут, что позволит удалить все связанные нуклеиновые кислоты.

И наконец, в течение двух часов промывают фосфатно-солевым буфером (PBS) децеллюляризированный матрикс печени (DLM) после завершения перфузии, если это необходимо; при этом иссекают все доли, кроме средней. Храните DLM в чистой герметичной чашке Петри с PBS при температуре 4 °C до момента использования. Для стерилизации DLM промойте его стерильным PBS, содержащим 0,1% уксусной кислоты и 4% этанола, и инкубируйте в течение трех часов при температуре 4 °C.

Затем дважды промойте DLM стерильным PBS. После этого промойте PBS, содержащим 2% пенициллина-стрептомицина (10 µg/mL), гентамицина и 2,5 µg/mL амфотерицина B. Храните децеллюляризованную печень в этом же растворе при температуре 4 °C до начала экспериментов по рецеллюляризации.

Во-вторых, для рецеллюляризации децеллюляризированного матрикса печени в ламинарном шкафу для культивирования тканей используйте перфузионную систему, аналогичную той, что применялась для децеллюляризации печени. Заполните перфузионную систему 200 milliliters культуральной среды, например, DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% fetal bovine serum, 100 units per milliliter пенициллина и 100 micrograms per milliliter стрептомицина.

Поместите DLM в перфузионную камеру и подключите ее к системе перфузии через канюлю воротной вены при работе насоса со скоростью 5 мл/мин. Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, дайте среде перфузировать DLM в течение 30 минут. Затем остановите поток в системе перфузии и медленно введите 50 миллионов гепатоцитов, выделенных из взрослой крысы, в систему перфузии через ловушку для пузырьков.

Возобновите поток со скоростью 10 milliliters per minute и рециркулируйте среду в течение 10 minutes. Снова остановите поток среды. Введите дополнительно 50 million гепатоцитов.

Затем снова возобновите поток со скоростью 10 мл в минуту. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока в DLM не будет введено в общей сложности 200 миллионов гепатоцитов. После того как все клетки будут введены в DLM, соберите эффузат в центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте при 800 об/мин в течение пяти минут.

Слейте супернатанты и объедините осадки в одной пробирке. Определите количество клеток и их жизнеспособность с помощью метода исключения трипанового синего. Это необходимо для установления эффективности посева культуры.

Клеточное заселение трансплантата печени. Подготовьте стерильную систему перфузии, включающую оксигенатор. Заполните систему перфузии 50 миллилитрами культурной среды, например, среды Williams E с 5% PBS и 0,5 ед/мл инсулина.

20 нг/мл EGF, 14 нг/мл глюкагона, 7,5 мкг/мл гидрокортизона, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Поместите клеточный печеночный трансплантат в перфузионную камеру и подсоедините его к системе перфузии через канюлю воротной вены при работающем насосе с потоком 5 мл/мин.

Чтобы избежать образования пузырьков воздуха, асептически закройте перфузионную камеру и плотно загерметизируйте ее, чтобы предотвратить любые утечки в процессе культивирования. Инкубируйте перфузионную систему при 37 °C в атмосфере 10% CO2 и увеличьте скорость потока перфузии до 15 mL/min. Подключите оксигенатор к баллону с газовой смесью 95% O2 и 5% CO2 и установите скорость потока газа на 0,5 L/min.

Это должно обеспечить парциальное давление кислорода примерно 400 миллиметров ртутного столба. Продолжайте культивирование до 10 дней, ежедневно заменяя культуральную среду. Ежедневно берите пробы среды для анализа секреции альбумина, мочевины и общих желчных кислот, чтобы контролировать функции печени трансплантата в конце периода культивирования.

Отозмите образцы децеллюляризированного трансплантата печени для молекулярного и гистологического анализа. Полная децеллюляризация печени крысы занимает около 72 часов при использовании описанного протокола.

В полученном матриксе сохраняется 100% фибриллярного коллагена, 50% гликозаминогликанов и лишь 5% ДНК нативной печени. Сосудистая структура матрикса сохраняется, что подтверждается результатами метода коррозионного литья и анализом с помощью сканирующей электронной микроскопии. Наличие сосудистой микроархитектоники в DLM облегчает повторное заселение его клетками с эффективностью 96% и его последующую перфузию.

Для культивирования in vitro трансплантат печи крысы можно поддерживать в течение до 10 дней, при этом он сохраняет надлежащие функции печени, что подтверждается секрецией альбумина, мочевины и общих желчных кислот. Таким образом, после просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить децеллюляризацию и рецеллюляризацию всей печени.