Анализ для количественного определения неорганических полифосфатов в бактериях

Неорганический полифосфат (polyP) представляет собой линейный фосфатный полимер, участвующий в бактериальной вирулентности и реакции на стресс, хранящийся в виде цитоплазматических гранул.

Для количественного определения polyP возьмите многолуночный планшет с возрастающими концентрациями стандартов неорганических фосфатов.

Добавьте очищенный бактериальный экстракт полиП в пустую лунку.

Введите в каждую лунку реакционный буфер, содержащий фермент экзополифосфатазу, и инкубируйте.

Фермент расщепляет полиП на свободный неорганический фосфат, превращая его в количественную форму.

Добавьте реагент для детектирования, содержащий молибдат и аскорбиновую кислоту, и инкубируйте.

Молибдат вступает в реакцию с фосфатами с образованием фосфомолибдатных комплексов, которые восстанавливаются аскорбиновой кислотой до комплексов синего цвета.

Измерьте впитываемость цветного комплекса. Измеряемая абсорбция соответствует интенсивности синего цвета, которая прямо пропорциональна концентрации фосфатов.

Постройте стандартную кривую и рассчитайте уровни фосфатов в образце, отражающие исходное содержание полиП в бактериях.

Начните с подготовки стандартов, содержащих ноль, пять, 50 или 200 микромолярных фосфатов калия в 50 миллимолярных pH восьми трисгидрохлоридах.

Распределите по 100 микролитров каждого стандарта фосфата и 100 микролитров экстрагированных образцов полиП в отдельные лунки прозрачной 96-луночной пластины. Приготовьте мастер-смесь, содержащую на образец 30 микролитров 5X ScPPX реакционного буфера, 19 микролитров воды и один микролитр очищенного ScPPX. Добавьте 50 микролитров мастер-смеси в каждую лунку 96-луночного планшета.

И выдерживать в течение 15 минут при температуре 37 градусов по Цельсию. В день обнаружения приготовьте свежий рабочий запас раствора для обнаружения, смешав 9,12 мл раствора обнаружения основания с 88 мл одного моляра аскорбиновой кислоты, и дайте ему дойти до комнатной температуры перед использованием. Добавьте 50 микролитров раствора для детектирования в каждый образец и стандарт в 96-луночный планшет.

Чтобы обеспечить развитие цвета, инкубируйте пластину при комнатной температуре в течение примерно двух минут. Используйте планшетный считыватель для измерения абсорбции на глубине 882 нанометров и рассчитайте концентрацию фосфатов в каждом образце по сравнению со стандартной кривой фосфата калия. Затем преобразуйте концентрации фосфатов в наномоли фосфата, полученного из polyP, в каждом лизате клетки и нормализуйте содержание полиP в клетках до общего клеточного белка, как описано в рукописи.