Анализ для количественного определения неорганических полифосфатов в бактериях

Неорганический полифосфат (polyP) представляет собой линейный фосфатный полимер, участвующий в бактериальной вирулентности и реакции на стресс, хранящийся в виде цитоплазматических гранул.

Для количественного определения polyP возьмите многолуночный планшет с возрастающими концентрациями стандартов неорганических фосфатов.

Добавьте очищенный бактериальный экстракт полиП в пустую лунку.

Введите в каждую лунку реакционный буфер, содержащий фермент экзополифосфатазу, и инкубируйте.

Фермент расщепляет полиП на свободный неорганический фосфат, превращая его в количественную форму.

Добавьте реагент для детектирования, содержащий молибдат и аскорбиновую кислоту, и инкубируйте.

Молибдат вступает в реакцию с фосфатами с образованием фосфомолибдатных комплексов, которые восстанавливаются аскорбиновой кислотой до комплексов синего цвета.

Измерьте впитываемость цветного комплекса. Измеряемая абсорбция соответствует интенсивности синего цвета, которая прямо пропорциональна концентрации фосфатов.

Постройте стандартную кривую и рассчитайте уровни фосфатов в образце, отражающие исходное содержание полиП в бактериях.

Начните с подготовки стандартов, содержащих ноль, пять, 50 или 200 микромолярных фосфатов к