Анализ репликации Legionella pneumophila в макрофагах, предварительно обработанных наружными мембранными везикулами

Начните с многолуночного планшета, содержащего предварительно обработанные макрофаги, подвергшиеся воздействию бактериальных пузырьков внешней мембраны Legionella pneumophila, или OMV.

Добавьте Legionella pneumophila в определенном соотношении бактерий и клеток-хозяев, чтобы заразить макрофаги, обработанные OMV.

Во время инкубации макрофаги интернализуют бактерии в мембранно-связанных фагосомах.

Предварительная обработка OMV изменяет передачу сигналов макрофагов, препятствуя созреванию фагосом.

Это способствует образованию вакуоли, содержащей легионеллу, которая защищает бактерии и обеспечивает внутриклеточную репликацию.

Добавьте моющее средство и инкубируйте для лизирования макрофагов. Это высвобождает внутриклеточные бактерии в среду.

Разбавьте разбавленный лизат на обогащенной питательными веществами агаровой пластине.

Во время инкубации бактерии растут и образуют видимые колонии.

Подсчитайте колонии, чтобы определить колониеобразующие единицы, или КОЕ, представляющие количество жизнеспособных бактерий.

Сравните количество КОЕ между обработанными и необработанными макрофагами.

Более высокий уровень КОЕ в макрофагах, обработанных OMV, по сравнению с необработанными макрофагами указывает на то, что OMV способствуют выживанию легионелл в макрофагах.

Инфицировать предварительно обработанные или необработанные клетки THP-1 ядром ядра В штамма L.pneumophila дикого типа или мышиные клетки BMDM мутантным веществом этого штамма, лишенным жгутиков, без изменения среды из клеток.

Добавьте бактерии при MOI 0,5, что составляет один умножить на 10, к пятому L.pneumophila на лунку. Инкубируйте культуры в течение 24 и 48 часов соответственно. Чтобы лизировать клетки, добавьте сапонин в конечной концентрации 0,1% и инкубируйте клетки в течение пяти минут.

Затем нанесите 50 микролитров требуемых разведений на агаровые пластины BCYE и инкубируйте пластины в течение трех дней.

Визуально подсчитывайте образовавшиеся колонии на глаз и проводите расчеты по текстовому протоколу.