Процедура забора бактерий и механического лизиса

Возьмем культуру золотистого стафилококка, бактерии с толстой пептидогликановой клеточной стенкой.

Разведите культуру в свежей среде, содержащей антибиотики, и инкубируйте ее при теплой температуре с встряхиванием, чтобы способствовать росту бактерий.

Переложите культуру в пробирку и центрифугируйте ее, чтобы гранулировать бактерии.

Выбросьте надосадочную жидкость и положите гранулу на лед, чтобы защитить бактерии от повреждений.

Повторно суспендируйте гранулу в буфере для лизиса и переложите ее в пробирку, содержащую гранулы диоксида кремния.

Вставьте трубку в инструмент для механического лизиса клеток и начните перемешивание.

Быстрые столкновения между бактериями и шариками создают поперечные силы. Это лизирует бактерии, высвобождая ДНК, РНК и РНК-белковые комплексы.

Ионы в буфере для лизиса стабилизируют структуры РНК, в то время как восстановители в буфере инактивируют ферменты, разрушающие РНК.

Теперь снова центрифугируйте смесь, чтобы измельчить мусор.

Соберите надосадочную жидкость, содержащую нуклеиновые кислоты и белки, для дальнейшего анализа.

Вырастите одну колонию штаммов, несущих либо pCN51 P3 MS2 sRNA, либо pCN51 P3 MS2 плазмиды в трех миллилитрах среды BHI с добавлением 10 мкг эритромицина на микролитр в дубликатах.

Разведите каждую ночную культуру в 50 миллилитрах свежей среды BHI с добавлением эритромицина до OD 600 0,05. Выращивайте культуры при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием при 180 об/мин в течение шести часов. Переложите каждую культуру в центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров и центрифугируйте пробирки при температуре 2,900 G в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, затем выбросьте надосадочную жидкость, заморозьте и храните их при температуре минус 80 градусов Цельсия или держите гранулы на льду и непосредственно выполняйте механический лизис клеток.

Чтобы выполнить механический лизис клеток, ресуспендируйте гранулы в пяти миллилитрах буфера А и перенесите ресуспендированные клетки в центрифужные пробирки объемом 15 миллилитров с 3,5 граммами гранул диоксида кремния. Вставьте трубки в механический прибор для лизиса клеток и запустите цикл продолжительностью 40 секунд со скоростью четыре метра в секунду. Центрифугируйте пробирки при температуре 2900 раз больше G в течение 15 минут, затем восстановите надосадочную жидкость и держите ее на льду.

Убедитесь, что надосадочная жидкость прозрачна, повторите центрифугирование, если его нет.