Выделение малой регуляторной РНК-связанной бактериальной целевой РНК с помощью аффинной очистки

Возьмем лизат бактериальной клетки, содержащий клеточные компоненты, в том числе меченую MS2 мРНК, связанную с ее целевой РНК.

MS2-меченая sRNA представляет собой сконструированную малую регуляторную РНК, несущую стволовую петлю аптамера MS2 на своем 5'-конце, которая проявляет высокое сродство к белку вирусной оболочки MS2.

Перенесите лизат бактерий в предварительно уравновешенную аффинную хроматографическую колонку, содержащую амилозную смолу, связанную с гибридными белками, состоящими из мальтозосвязывающего белка (MBP) и белка оболочки MS2.

Иммобилизованный белок оболочки MS2 специфически захватывает аптамерную стволовую петлю меченой MS2 сРНК, сохраняя неповрежденную целевую РНК, связанную с РНК

.

Непомеченные молекулы, которые остаются несвязанными, собираются в проточном канале.

Промойте колонку буфером, чтобы удалить остаточные несвязанные молекулы.

Элюируйте буфером, содержащим мальтозу, который вытесняет MBP из смолы, высвобождая меченную MS2 sRNA, связанную с ее целевой РНК.

Собирайте и храните фракции на льду, чтобы сохранить целостность РНК для последующего анализа.

Снимите наконечник колонки, затем поместите колонку для хроматографии в решетку для колонки и промойте колонку сверхчистой водой. Добавьте 300 микролитров амилозной смолы и промойте колонку 10 миллилитрами буфера А. Разведите 1, 200 пикамолей белка MBP-MS2 в шести миллилитрах буфера А и загрузите его в колонку.

Промойте колонку с 10 миллилитрами буфера А. Далее проведите MS2-аффинную очистку. Загрузите лизат клеток в колонку и соберите проточную фракцию в чистую сборную трубку. Трижды промыть колонку 10 миллилитров буфера А и собрать фракцию промывки, затем вымыть колонку одним миллилитром буфера Е и собрать фракцию элюирования в двухмиллилитровую микропробирку.

Все собранные фракции держать на льду до извлечения РНК.