Метод микроразведения бульона для определения чувствительности грамположительных бактерий к антибиотикам

Выделите колонии грамположительных бактерий из культурального планшета и суспензируйте их в среде.

Разбавляют суспензию до достижения оптимальной бактериальной концентрации для анализа.

Инокулируют в тестовые лунки микропланшета, содержащего возрастающие концентрации липогликопептидного антибиотика, и лунки для контроля роста, содержащей только среду.

Распределите аликвоту из контрольной лунки по культуральным планшетам для проверки чистоты культуры и количества бактерий.

Инкубируйте для роста бактерий, во время которых происходит синтез клеточной стенки.

Антибиотик связывается с пептидогликаном, компонентом клеточной стенки, и его предшественниками, ингибируя полимеризацию и ослабляя стенку.

Нарушение позволяет осмотическому давлению вызывать лизис клеток.

После инкубации подтвердите чистоту культуры и оптимальное количество бактерий.

Осмотрите лунки на предмет роста бактерий.

Контрольная лунка показывает видимый рост, в то время как тестовая лунка с самой низкой концентрацией антибиотика, которая полностью подавляет рост, показывает минимальную ингибиторную концентрацию (МИК).

В этой демонстрации будет сделана прививка одной свежеприготовленной тарелки. Чтобы приготовить инокулюм, выберите несколько хорошо изолированных колоний из кровяного агара для 18-24 часов или другой неселективной агаровой пластины. Здесь используется контроль качества штаммов S. aureus и E. faecalis.

Прикоснитесь к верхней части каждой колонии стерильным тампоном и перенесите часть его в пробирку, содержащую от одного до пяти миллилитров CAMHB или физиологического раствора. Продолжайте перекладывать до тех пор, пока мутность не достигнет стандарта 0,5 по Макфарланду в течение 15-30 минут после приготовления, разведите инокулюм в соотношении от одного до 100 в CAMHB, чтобы получить концентрацию от пяти до 10 до пятого КОЕ на миллилитр. Допустимый диапазон составляет от двух до восьми умножить на 10 до пятой КОЕ на миллилитр.

Сразу же с помощью многоканальной пипетки со стерильными наконечниками перенесите по 50 микролитров конечного инокулята в каждую соответствующую лунку пластины панели MIC. Здесь каждый из двух изолятов инокулируется в четыре ряда, что в общей сложности составляет четыре репликации на изолят. Затем, чтобы выполнить проверку чистоты, с помощью пипетки переведите от одного до 10 микролитров раствора с положительным контролем роста в неселективный агар, такой как триптиказный соевый агар с 5% овечьей крови.

Используйте стерильную петлю для распределения раствора по поверхности пластины. Поверните пластину на 90 градусов и снова протрите, чтобы убедиться, что инокулюм равномерно распределен. Накройте тарелку крышкой и отставьте ее в сторону.

При подготовке к подсчету колонии с помощью одноканальной пипетки переведите 10 микролитров раствора из лунки для контроля роста на 10 миллилитров солевой смеси, а затем переведите 100 микролитров в подходящую неселективную агаровую среду, такую как триптиказный соевый агар с 5% овечьей кровью, используя стерильную петлю, распределите раствор по всей поверхности агара. Повторите этот процесс два раза в разных направлениях, чтобы обеспечить равномерное распределение инокулята. Затем сложите до четырех панелей MIC в пластиковый контейнер, убедившись, что верхняя панель плотно закрыта крышкой.

Затем поместите влажное бумажное полотенце внутрь пластикового контейнера и надежно закройте его крышкой в течение 30 минут после прививки. Инкубируйте панели MIC, планшет для подсчета колоний и планшет для проверки чистоты в инкубаторе окружающего воздуха при температуре 35 плюс-минус два градуса Цельсия в течение 16–20 часов. На следующий день прочитайте минимальную ингибиторную концентрацию как самую низкую концентрацию, которая полностью подавляет рост бактерий в лунках, обнаруженных невооруженным глазом.

Определите количество колоний на табличке для подсчета колоний. Умножьте подсчитанное число на коэффициент разбавления. Например, 50 колоний умножить на коэффициент разбавления 10 000 равно пяти умножить на 10 к пятому КОЕ на миллилитр.

Приемлемый диапазон составляет от 20 до 80 колоний, что соответствует двум-восьми умножить на 10 пятых колонийобразующих единиц на мл. Концентрация инокулюма является важной переменной для контроля тестирования на чувствительность с целью получения точных результатов. Наконец, проверьте табличку чистоты.

Если все колонии схожи с колониями, используемыми в качестве инокулята, то его можно считать чистым. Если присутствуют какие-либо другие колонии, то существует вероятность присутствия загрязняющего вещества в панели MIC, и тест следует повторить.