JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 2:58 мин • August 29th, 2025
Возьмем предметное стекло в камере, содержащее эпителиальные клетки человека с флуоресцентно мечеными эндосомами.
Внедряют внутриклеточные болезнетворные бактерии и инкубируют, позволяя им прилипать к клеткам.
Бактерии впрыскивают белки, которые реорганизуют цитоскелет хозяина, образуя мембранные выступы, которые интернализуют бактерии в вакуоли.
Эти вакуоли расширяют канальцевые выступы, соединяющиеся с эндолизосомальной системой, сетью везикул и органелл, регулирующих внутриклеточный транспорт.
Эти проекции перенаправляют транспорт везикул и ремоделируют эндолизосомальную систему.
Промойте для удаления внеклеточных бактерий, затем инкубируйте с антибиотикосодержащей средой, чтобы уничтожить все оставшиеся бактерии.
Замените на бессывороточную среду для визуализации, содержащую антибиотик, и добавьте наночастицы, помеченные контрастным флуорофором.
Инкубируйте для обеспечения проникновения наночастиц через эндоцитоз и накопления в ремоделируемых везикулах.
Промойте для удаления неинтернализованных наночастиц, затем инкубируйте в среде для визуализации с добавлением сыворотки.
Флуоресцентные наночастицы и меченые эндосомы позволяют визуализировать индуцированное бактериями эндолизосомальное ремоделирование.
Чтобы начать эту процедуру, измерьте наружный диаметр 600 субкультивируемых бактерий и разбавьте до наружного диаметра 600 0,2 в одном миллилитре PBS, добавьте соответствующее количество бактерий к клеткам HeLa в предметном стекле с 8-луночной камерой для достижения кратности инфекции 100. Инкубировать в течение 30 минут в клеточном инкубаторе.
Промойте клетки HeLa три раза PBS, чтобы удалить неинтернализованные бактерии. Этот момент времени устанавливается как нулевой час после заражения или нулевой час p.i. Добавьте в клетки 300 микролитров свежей питательной среды, содержащей 100 микрограмм гентамицина на миллилитр и выдержите в течение одного часа.
Через час замените среду средой для визуализации, содержащей 10 микрограммов гентамицина на миллилитр. Добавьте НЧ золота-BSA-родамина в клетки HeLa для получения конечной концентрации OD 520 0,1.
Выдерживать в течение одного часа. Через час удалите среду и трижды промойте PBS. Наконец, добавьте 300 микролитров свежей среды для визуализации, содержащей 10 процентов FCS и 10 микрограммов гентамицина на миллилитр до конца инкубации.