Культивирование микобактерий туберкулеза в условиях повышенного содержания железа

Начните с агаровой тарелки, содержащей колонии Mycobacterium tuberculosis , выращенных на среде, обогащенной питательными веществами.

Введите одну колонию в бульон, обогащенный питательными веществами, и инкубируйте с перемешиванием для равномерного роста.

Дайте культуре достичь поздней логарифмической фазы, когда клетки метаболически активны.

Нанесите небольшой объем на обогащенную агаровую пластину, равномерно распределите ее и инкубируйте до образования непрерывного бактериального слоя.

Смочите стерильный тампон средой с низким содержанием железа (LIMM) и соберите бактерии.

Подвесьте их в пластиковом контейнере с LIMM, чтобы избежать загрязнения железом.

Добавьте диспергирующий агент, чтобы предотвратить образование комков, и инкубируйте без встряхивания.

В условиях, ограничивающих содержание железа, бактерии активируют стрессовые реакции и продуцируют сидерофоры в цитоплазме.

Они упаковываются во внеклеточные везикулы и высвобождаются в окружающую среду.

Сидерофоры захватывают железо и помогают бактериям выживать.

Эта система подчеркивает адаптацию микобактерий и выживание в условиях с ограниченным содержанием железа

Инокулируют одну колонию МБТ в два миллилитра среды микобактериального бульона с добавлением обогащения АДН. Инкубировать с перемешиванием при 37 градусах Цельсия. Когда появится видимый рост, извлеките два миллилитра культуры и измерьте наружный диаметр 540 на спектрофотометре.

Прекращайте инкубацию, когда наружный диаметр 540 достигнет 0,8, что указывает на позднюю логарифмическую фазу. Распределите 200 микролитров поздней логарифмической культуры на агаровые пластины микобактерий с добавлением 0,2 глицерина, 0,5% Tween 80 и ADN. Привите не менее пяти пластин.

Инкубируйте пластины при температуре 37 градусов Цельсия. А через неделю бактериальный рост виден в виде сливающегося слоя. Затем смочите стерильный ватный тампон в среде с низким содержанием железа.

Используйте этот тампон для сбора бактерий с агаровых пластин. Инокулируйте бактерии в 100 миллилитров среды с низким содержанием железа в пробирке. Соберите достаточное количество бактерий для приготовления суспензии с наружным диаметром 540 единицы.

Разведите суспензию в 10 раз до одного литра с низким содержанием железа минимальным средством и разделите ее на две стерильные пластиковые бутылки. Далее перелейте два миллилитра культуры в пятимиллилитровую пробирку для культуры. Добавьте 10 микролитров 10% объемного тилоксапола.

Инкубируйте культуры при температуре 37 градусов Цельсия в течение 14 дней.