Выделение сидерофорсодержащих внеклеточных везикул из Mycobacterium tuberculosis

Возьмите культуру Mycobacterium tuberculosis , выращенную в железоограничивающей среде для усиления секреции внеклеточных везикул, содержащих сидерофоры, хелатор железа.

Центрифуга для гранулирования бактерий.

Соберите надосадочную жидкость и отфильтруйте ее, чтобы удалить остатки бактерий.

Переведите фильтрат в систему ультрафильтрации с перемешиванием и отфильтруйте для удаления излишков фильтрующего материала и концентрирования EV.

Центрифугируйте концентрат для гранулирования клеточного мусора.

Перенесите надосадочную жидкость в ультрацентрифужную трубку и центрифугу для сбора гранул EV.

Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в буфере и смешайте ее с концентрированной средой градиента плотности для формирования нижнего слоя.

Наложение с уменьшением концентрации градиентной среды для создания прерывистого градиента плотности.

Добавьте буфер сверху и центрифугуйте. Электромобили мигрируют в слой, который соответствует их плотности плавучести.

Соберите каждую фракцию в отдельную пробирку.

Очищенная фракция с ВВ, содержащими сидерофоры, готова к последующим исследованиям.

Переложите культуру в пять конических пробирок центрифуги объемом 225 миллилитров и центрифугируйте при температуре 2850 м g в течение семи минут при температуре 20 градусов Цельсия. Соберите надосадочную жидкость культуры с помощью пипетки объемом 50 миллилитров и профильтруйте, простерилизуйте ее через фильтр 0,22 мкм.

Чтобы выделить MEV, перенесите фильтрат культуры в систему ультрафильтрации с перемешиванием клеток, расположенную при температуре четыре градуса Цельсия, и отфильтруйте концентрат под давлением менее 50 фунтов на квадратный дюйм через отсечную мембрану мощностью 100 килодальтон. Затем центрифугируют концентрированный фильтрат культуры при 15 000 умноженных на g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия и собирают надосадочную жидкость в поликарбонатные ультрацентрифугирующие пробирки. Центрифугируйте надосадочную жидкость при 100 000 умноженных на g в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.

После этого удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте мембранные гранулы в общей сложности в одном миллилитре стерильного PBS путем щадящего пипетирования. Смешайте 0,5 миллилитра гранулированной суспензии с 1,5 миллилитрами 60% раствора йодиксанола на дне полипропиленовой тонкостенной ультрацентрифужной пробирки. Сверху наложите на эту суспензию йодиксанола MEV 45% с одним миллилитром 40%, 35%, 30%, 25% и 20% растворов йодиксанола и одним миллилитром PBS.

Центрифугируйте при 100 000 умноженных на g в течение 18 часов при четырех градусах Цельсия. Затем с помощью одномиллилитрового шприца Гамильтона соберите фракции градиента плотности в один миллилитр, начиная сверху. Разбавьте каждую собранную фракцию до 20 миллилитров с помощью PBS и центрифугируйте при 100 000 умноженных на г в течение двух часов при четырех градусах Цельсия.

Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте в 0,5 миллилитрах PBS.