Выделение бактериальных внеклеточных везикул с помощью эксклюзионной хроматографии
JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 3:24 мин • September 26th, 2025
Возьмите хроматографию исключения из размера или колонку SEC, заполненную гранулами пористой смолы определенного размера. Он содержит резервуар для проб в верхней части.
Добавьте фосфатно-солевой раствор или PBS, чтобы уравновесить бусины-колонны, и выбросьте протекание.
Загрузите концентрированный фильтрат бактериальной культуры, содержащий внеклеточные везикулы или ВВ, секретируемые белки и загрязняющие вещества.
EV — это нановезикулы на основе липидов, которые переносят биологически активные молекулы и выделяются бактериями.
Как только фильтрат попадет в шарики, добавьте PBS, чтобы пропустить его через слой смолы.
Выбросьте исходный элюат, содержащий крупные невезикулярные загрязнения.
Поместите трубку для сбора под выпускное отверстие и последовательно добавьте PBS.
Крупногабаритные электромобили обходят более мелкие поры смолы, перемещаются через межчастичные пространства между шариками и сначала элюируются.
Более мелкие белки и загрязняющие вещества проникают в поры, идут более длинными путями и позже вымываются.
Соберите фракции с ранним покрытием, содержащие EV, и сохраните их для анализа.
Для выделения ВВ проводят эксклюзионную хроматографию (SEC) с использованием небольшой колонки с объемом слоя 10 миллилитров для менее чем 100 миллилитров исходного материала и большой колонки с объемом слоя 47 миллилитров для более чем 100 миллилитров исходного материала. За несколько часов до эксперимента доведите колонну SEC и PBS до комнатной температуры, после чего стабилизируйте колонну в вертикальном положении с помощью стандартного лабораторного стенда и держателя. Перед подключением к колонне SEC увлажните резервуар для пробы, позволив пяти миллилитрам PBS течь через фритту в контейнер для отходов.
Затем открутите впускную крышку колонны, чтобы добавить два миллилитра PBS в резервуар для пробы, и осторожно подсоедините резервуар к колонне, так как PBS капает через фритту. Для уравновешивания колонки добавьте 47 миллилитров PBS в резервуар для пробы, после чего откройте дно колонки SEC. Затем дайте всему загруженному буферу образца протекать через колонку и отбросьте протекающий поток.
После загрузки двух миллилитров пробы в резервуар для проб дайте пробе полностью войти в колонку и соберите проточный. Немедленно добавьте PBS в резервуар для проб в объеме 14,25 миллилитров за вычетом объема пробы, чтобы раствор мог протекать через колонку, при этом отбраковывайте количество, равное объему пустоты в колонке. Затем поместите двухмиллилитровую микротрубку с низким связыванием непосредственно под колонной SEC, чтобы собрать первую проточную или фракционную микротрубку после того, как через колонку пройдут два миллилитра PBS.
Продолжайте добавлять два миллилитра PBS в резервуар для пробы, чтобы собрать каждую последующую фракцию. Собранные фракции хранят при температуре четыре градуса Цельсия при кратковременном хранении или при температуре минус 80 градусов Цельсия при длительном хранении.
Обзор
В данной статье описывается процесс выделения внеклеточных везикул (EVs) из бактериальных культур с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC). Метод заключается в нанесении концентрированного фильтрата бактериальной культуры на колонку для SEC и сборе ранних фракций элюирования, содержащих EVs, для последующего анализа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Биология
- Биохимия
Теоретические сведения
- Внеклеточные везикулы (EVs) представляют собой липидные нановезикулы, секретируемые бактериями.
- EVs переносят биоактивные молекулы и играют роль в межклеточной коммуникации.
- Эксклюзионная хроматография — это метод, используемый для отделения EVs от примесей.
- Данный метод позволяет получать чистые EVs для последующего использования в различных целях.
Цель исследования
- Выделение и очистка внеклеточных везикул из бактериальных культур.
- Представление детального протокола использования эксклюзионной хроматографии.
- Обеспечение анализа биоактивных молекул, переносимых внеклеточными везикулами.
Используемые методы
- Подготовка колонки для SEC с пористыми смоляными гранулами.
- Уравновешивание колонки с использованием фосфатно-солевого буферного раствора (PBS).
- Нанесение концентрированного фильтрата бактериальной культуры на колонку.
- Последовательный сбор фракций на основе принципов эксклюзии по размеру.
Основные результаты
- Успешное выделение внеклеточных везикул (EVs) из фильтрата культуры бактерий.
- Фракции, элюировавшиеся раньше, содержали преимущественно EVs, в то время как более поздние фракции содержали примеси.
- Протокол обеспечивает эффективное разделение EVs для последующего анализа.
- Установлены условия хранения собранных фракций для краткосрочного и долгосрочного использования.
Выводы
- Эксклюзионная хроматография является эффективным методом выделения внеклеточных везикул (EVs) из бактериальных культур.
- Данный протокол представляет собой надежный подход, позволяющий исследователям получать чистые EVs.
- Дальнейший анализ EVs может дать представление об их биологической роли.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Эффективное выделение бактериальных внеклеточных везикул (ВКВ) с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) обеспечивает воспроизводимый доступ к биоактивным нановезикулам для исследований на ранних этапах поиска и изучения механизмов действия. Этот масштабируемый подход позволяет получать стандартизированные препараты ВКВ, что облегчает проведение сравнительного анализа и трансляционных исследований в рамках портфелей НИОКР биофармацевтических компаний. Надежное выделение ВКВ является основой для валидации мишеней и снижения рисков при изучении взаимодействий между микробами и хозяином.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет исследовать сигнальные пути и молекулярный груз, опосредованные бактериальными внеклеточными везикулами.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней путем предоставления очищенных везикул для последующих анализов.
- Способствует снижению механистических рисков при изучении взаимодействий между микробами и хозяином.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение стандартизированных препаратов внеклеточных везикул (EV) для разработки методов анализа и скрининга соединений.
- Повышает воспроизводимость и сопоставимость количественных показателей в анализах на основе везикул.
- Обеспечивает масштабируемость рабочих процессов для высокопроизводительного скрининга активностей, связанных с внеклеточными везикулами.
Трансляционные и доклинические исследования
- Поддерживает исследование EV в качестве трансляционных биомаркеров в исследованиях инфекций и микробиома.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации механизмов, опосредованных EV.
- Способствует продвижению концепций терапии, нацеленной на EV, с учетом оценки рисков.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Выделение внеклеточных везикул (EV) методом эксклюзионной хроматографии (SEC) вписывается в континуум от ранних этапов поиска до доклинических исследований, обеспечивая воспроизводимый способ получения препаратов везикул для механистических, скрининговых и трансляционных рабочих процессов.
- Открывающая биология: Облегчает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигналов путем выделения интактных EV для функциональных исследований.
- Скрининг: Позволяет получать фракции EV, готовые для анализа, с минимальным загрязнением белками для получения надежных результатов скрининга.
- Аналитика: Обеспечивает количественное измерение выхода и чистоты везикул, что позволяет проводить сравнения между различными условиями.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает получение стандартизированных образцов EV для исследований биомаркеров и механизмов, имеющих значение для моделей заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: Создает масштабируемую, многократно используемую платформу для выделения EV из различных бактериальных систем.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов в исследованиях механизмов, опосредованных EV, и при валидации мишеней.
- Операционная ценность: улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость рабочих процессов выделения EV.
- Стратегическая ценность: оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработок за счет снижения биологической неопределенности в анализах на основе везикул.
- Влияние на портфель: обеспечивает приоритизацию исследовательских и трансляционных проектов, связанных с EV, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с методами хроматографии и знания в области биологии везикул.
- Необходим доступ к колонкам для SEC, подходящей смоле и аналитической инфраструктуре для характеристики везикул.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов сбора и хранения фракций.
- Метод применим к различным видам бактерий с учетом вариабельности размера и выхода везикул.
- На чистоту и выход фракций могут влиять сложность образца и параметры колонки.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Исключение размеров Хроматография для анализа гетерогенности везикул наружной мембраны бактерий
Похожие видео
0 Просмотры
Эксклюзионная хроматография для отделения внеклеточных везикул от кондиционированных клеточных культуральных сред
Похожие видео
0 Просмотры
Микобактерии туберкулеза Обогащение внеклеточных пузырьков с помощью хроматографии с исключением размеров
Похожие видео
0 Просмотры
Выделение и обогащение внеклеточных везикул внешнего мембранного происхождения от бактерий
Похожие видео
0 Просмотры
Разделение бактериальных внеклеточных везикул на основе эксклюзионной хроматографии: метод выделения гетерогенной популяции грамнегативных бактериальных наружных мембранных везикул в зависимости от их размера
Похожие видео
0 Просмотры
Метод эксклюзионной хроматографии для очистки внеклеточных пузырьков микобактерий
Похожие видео
0 Просмотры
Характеристика экстраклеточных пузырьков, полученных из иммунных клеток, и изучение функционального воздействия на клеточную среду
Похожие видео
0 Просмотры
Масштабируемое выделение и очистка внеклеточных везикул от кишечной палочки и других бактерий
Похожие видео
0 Просмотры
Оптимизация параметров проточной цитометрической сортировки для высокопроизводительной изоляции и очистки малых внеклеточных везикул
Похожие видео
0 Просмотры
Одноэтапное выделение внеклеточных везикул из образцов большого объема с помощью раздвоенного микрофлюидного устройства A4F
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026