Выделение бактериальных внеклеточных везикул с помощью эксклюзионной хроматографии

Возьмите хроматографию исключения из размера или колонку SEC, заполненную гранулами пористой смолы определенного размера. Он содержит резервуар для проб в верхней части.

Добавьте фосфатно-солевой раствор или PBS, чтобы уравновесить бусины-колонны, и выбросьте протекание.

Загрузите концентрированный фильтрат бактериальной культуры, содержащий внеклеточные везикулы или ВВ, секретируемые белки и загрязняющие вещества.

EV — это нановезикулы на основе липидов, которые переносят биологически активные молекулы и выделяются бактериями.

Как только фильтрат попадет в шарики, добавьте PBS, чтобы пропустить его через слой смолы.

Выбросьте исходный элюат, содержащий крупные невезикулярные загрязнения.

Поместите трубку для сбора под выпускное отверстие и последовательно добавьте PBS.

Крупногабаритные электромобили обходят более мелкие поры смолы, перемещаются через межчастичные пространства между шариками и сначала элюируются.

Более мелкие белки и загрязняющие вещества проникают в поры, идут более длинными путями и позже вымываются.

Соберите фракции с ранним покрытием, содержащие EV, и сохраните их для анализа.

Для выделения ВВ проводят эксклюзионную хроматографию (SEC) с использованием небольшой колонки с объемом слоя 10 миллилитров для менее чем 100 миллилитров исходного материала и большой колонки с объемом слоя 47 миллилитров для более чем 100 миллилитров исходного материала. За несколько часов до эксперимента доведите колонну SEC и PBS до комнатной температуры, после чего стабилизируйте колонну в вертикальном положении с помощью стандартного лабораторного стенда и держателя. Перед подключением к колонне SEC увлажните резервуар для пробы, позволив пяти миллилитрам PBS течь через фритту в контейнер для отходов.

Затем открутите впускную крышку колонны, чтобы добавить два миллилитра PBS в резервуар для пробы, и осторожно подсоедините резервуар к колонне, так как PBS капает через фритту. Для уравновешивания колонки добавьте 47 миллилитров PBS в резервуар для пробы, после чего откройте дно колонки SEC. Затем дайте всему загруженному буферу образца протекать через колонку и отбросьте протекающий поток.

После загрузки двух миллилитров пробы в резервуар для проб дайте пробе полностью войти в колонку и соберите проточный. Немедленно добавьте PBS в резервуар для проб в объеме 14,25 миллилитров за вычетом объема пробы, чтобы раствор мог протекать через колонку, при этом отбраковывайте количество, равное объему пустоты в колонке. Затем поместите двухмиллилитровую микротрубку с низким связыванием непосредственно под колонной SEC, чтобы собрать первую проточную или фракционную микротрубку после того, как через колонку пройдут два миллилитра PBS.

Продолжайте добавлять два миллилитра PBS в резервуар для пробы, чтобы собрать каждую последующую фракцию. Собранные фракции хранят при температуре четыре градуса Цельсия при кратковременном хранении или при температуре минус 80 градусов Цельсия при длительном хранении.