Бактериальная трансинфекция Т-клеток in vitro путем формирования иммунологических синапсов

Начните с лунок, содержащих CD4⁺ Т-клетки, экспрессирующие рецепторы, специфичные к пептиду овоальбумина или OVAp.

В отрицательную контрольную лунку поместите пористую мембранную вставку.

Возьмите в пробирку дендритные клетки, зараженные бактериями и загруженные OVAp для поверхностного проявления.

Добавьте дендритные клетки непосредственно в тестовую лунку и во вставку в отрицательную контрольную лунку.

Добавьте в лунки среду и инкубируйте.

В тестовой лунке клетки взаимодействуют, образуя иммунологический синапс, облегчая перенос бактерий от дендритной клетки к Т-клетке, процесс, известный как трансинфекция.

В лунке отрицательного контроля мембранный барьер препятствует межклеточному взаимодействию, тем самым подавляя трансинфекцию.

Добавьте в лунки антибиотик гентамицин и инкубируйте.

Гентамицин не может проникать в эукариотические клетки, таким образом, убивая только неинтернализованные бактерии, в то время как интернализованные бактерии выживают.

Тестовый образец, содержащий инфицированные Т-клетки, и контрольный образец с неинфицированными Т-клетками теперь готовы к выделению Т-клеток и количественному определению трансинфекции.

К 24-луночному культуральному планшету добавьте два миллиона CD4⁺ Т-клеток в объеме 0,5 миллилитра в каждую из пяти лунок.

Затем, для контроля физического контакта, поместите поликарбонатные межлуночные барьеры с размером пор три микрометра в третью и четвертую лунки. В первую лунку добавьте 0,1 миллилитра зараженных перегруженных дендритных клеток. Во вторую лунку добавьте 0,1 миллилитра зараженных не загруженных дендритных клеток.

Добавьте 0,1 миллилитра инфицированных перегруженных дендритных клеток в одну лунку и 0,1 миллилитра инфицированных незагруженных дендритных клеток в другую лунку. Наконец, в качестве отрицательного контроля, напрямую инфицируйте пятую лунку CD4⁺ Т-клеток с MOI 10. Затем доведите общий объем лунки до 0,6 миллилитра с помощью RPMI.

Инкубируйте планшет в течение 30 минут, чтобы сформировались иммунные синапсы. После инкубации добавьте в каждую лунку по 100 мкг Гентамицина на миллилитр среды, и выдерживайте в течение одного часа. Гентамицин – аминогликозидный антибиотик, который не способен проникать в эукариотические клетки.

Таким образом, на этом этапе аминогликозид убивает внеклеточные бактерии, но не внутриклеточные.