Оценка прикрепления пневмококка к первичным эндотелиальным клеткам человека при постоянном потоке среды

Поместите покрытое желатином предметное стекло, подключенное к микрофлюидному насосу, на предметный столик микроскопа.

Слайд содержит первичные эндотелиальные клетки человека, культивируемые в текучей среде, с нитями фактора фон Виллебранда или VWF, гликопротеина, на поверхности клетки.

Эти нити генерируются путем стимуляции клеток гистамином.

Контролируемый поток среды, подаваемый через микрофлюидный насос, способствует секреции и разматыванию VWF. При этом в строках VWF предоставляются определенные домены привязки.

Остановите поток среды, добавьте зеленое флюорконъюгированное VWF-специфическое антитело и возобновите поток, чтобы пометить нити антителом.

Приостановите поток среды и введите красные флуоресцентные белки-экспрессирующие бактерии пневмококков.

Возобновите поток, чтобы распределить бактерии, обеспечивая прикрепление к обнаженным доменам через поверхностные адгезины.

Используя флуоресцентную микроскопию, визуализируйте связывание бактерий с нитями в режиме реального времени.

Остановите поток среды и получите изображения Z-стека для количественной оценки прикрепления бактерий к эндотелиальным клеткам.

Для микроскопической визуализации поместите жидкостный блок в камеру нагрева при температуре 37 градусов Цельсия. Поместите предметное стекло канала на предметный столик разогретого микроскопа.

Контролируйте морфологию клеток и целостность слоя HUVEC перед введением гистамина и бактерий в циркуляцию потока. Сохраняйте настройку потока. Индуцировать высвобождение VWF из эндотелиальных жизнеспособных тельец Palade путем введения 136 микролитров 100 миллимолярного стокового раствора гистамина через инъекционный порт в среду ECGMS, циркулирующую в перфузионной трубке.

Для иммунофлуоресцентного детектирования мультимеризованных серий VWF вводят 20 мкг специфического конъюгированного антитела VWF FITC в объеме 200 мкл PBS в циркулирующие 13,6 мл среды ECGMS. Для количественного определения присоединения пневмококковой инфекции к строкам VWF, образующимся на поверхностях клеток HUVEC, введите в среду ECGMS в 1,35 раза по 10 до восьмого раза по 10 КОЕ на миллилитр, экспрессирующий пневмококки в максимальном объеме одного миллилитра с помощью инъекционного порта. Выберите объектив с 63-кратным погружением в масло для увеличения микроскопа и настройте флуоресцентный фильтр в программном обеспечении микроскопа на канал RFP с фильтром обнаружения 540 нанометров для обнаружения RFP, экспрессирующих пневмококки.

Для количественной оценки прикрепления бактерий к строкам VWF создайте снимки стеков Z, состоящих по крайней мере из 30 репрезентативных полевых представлений, каждый из которых содержит примерно 10 морфологически неповрежденных HUVEC, и подсчитайте количество пневмококков.