Флуоресцентная визуализация бактериальной инфекции, ассоциированной с биоматериалом, у эмбрионов рыбок данио

Начните с обезболенных эмбрионов данио-рерио, которым вводили флуоресцентно меченые патогенные бактерии, отдельно или в смеси с микросферами биоматериала, чтобы смоделировать инфекцию, связанную с биоматериалом, in vivo.

Поместите чашку Петри, содержащую базальные среды с анестетиком, на столик стереофлуоресцентного микроскопа, оснащенного соответствующими фильтрами.

Добавьте в чашку раствор метилцеллюлозы, чтобы создать вязкую среду, которая обездвиживает эмбрионы для визуализации.

Перенесите отдельные эмбрионы в метилцеллюлозу и выровняйте их горизонтально, убедившись, что место инъекции видно.

Используя фильтр светлого поля, сосредоточьтесь на месте инъекции, чтобы нацелиться на зараженную область.

Задайте параметры визуализации Z-стека и получите флуоресцентные изображения на разной глубине, чтобы зафиксировать динамику инфекции в трех измерениях.

Используя программное обеспечение, анализируйте изображения, полученные с течением времени, чтобы количественно оценить интенсивность флуоресценции и контролировать распределение бактерий.

Этот протокол позволяет напрямую сравнивать прогрессирование инфекции у живых эмбрионов с воздействием биоматериала и без него.

Поместите 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую среду Е3 с добавлением 0,02% трикаина, на столик стереофлуоресцентного микроскопа и добавьте в чашку Петри 500 микролитров 2% метилцеллюлозы. Чтобы контролировать развитие инфекции с помощью флуоресцентной микроскопии, оборудуйте соответствующими светлопольными и флуоресцентными фильтрами, выровняйте обезболенные инфицированные эмбрионы горизонтально в пятне метилцеллюлозы в чашке Петри.

Используйте светопольный фильтр, чтобы сфокусировать поврежденную введенную ткань с 160-кратным увеличением. Установите глубину Z-стека на 10 микрометров и размер шага на пять микрометров, чтобы можно было записать три последовательных изображения. Затем визуализируйте отдельные эмбрионы с идентичными оптимизированными настройками при 160-кратном увеличении.

Используйте плагин ObjectJ в ImageJ для анализа изображений.