Анализ in vivo бактериальных инфекций, ассоциированных с имплантатами, с использованием эмбрионов рыбок данио

Начните с посуды, содержащей агарозную камеру, отлитую с углублениями.

Каждая бороздка содержит обезболенные эмбрионы данио-рерио, погруженные в эмбриональную среду с добавлением анестетика.

Под световым микроскопом введите в мышечную ткань иглу для микроинъекций.

Введите суспензию, содержащую S. aureus и микросферы полистирола, чтобы смоделировать инфекцию, ассоциированную с имплантатом.

Переведите введенные эмбрионы в отдельные лунки многолуночной пластины, заполненной свежей средой, и инкубируйте.

Микросферы имеют физическую поверхность, которая поддерживает колонизацию бактерий и способствует инфекции.

Чтобы оценить бактериальную инфекцию, ассоциированную с имплантатом, перенесите каждый эмбрион в отдельную пробирку и промойте ее буфером. Добавьте буфер и керамические шарики.

Гомогенизируйте для лизирования эмбрионов и высвобождения внутреннего содержимого, включая бактерии.

Выложите на тарелки разведенные гомогенаты, затем инкубируйте, чтобы дать возможность образоваться колонии.

Эмбрионы, введенные с микросферно-бактериальной суспензией, демонстрируют более высокое количество колоний, чем эмбрионы, введенные только с бактериальной суспензией. Это свидетельствует о том, что микросферы повышают восприимчивость к инфекции.

Подождав пять минут, пока эмбрионы будут обезболены, выровняйте эмбрионы в бороздках в одной ориентации для их инъекции. Установите микроинъектор на соответствующие настройки инъекции и введите иглу в мышечную ткань первого эмбриона под углом от 45 до 60 градусов под стереомикроскопом.

Осторожно перемещайте иглу вперед и назад, чтобы при необходимости отрегулировать положение внутри ткани, и используйте ножную педаль микроинжектора для введения загруженной суспензии. При введении суспензии бактериальной микросферы в ткани эмбрионов данио-рерио иглу следует вводить аккуратно, но твердой рукой. После успешного введения перед инъекцией должно быть создано пространство для материалов.

И поддерживать эмбрионы в среде Е3 без трикаина в индивидуальных лунках по 48 лунок с ежедневными сменами среды. Чтобы контролировать прогрессирование инфекции с помощью количественного определения колониеобразующих единиц, случайным образом перенесите пять-шесть жизнеспособных инфицированных эмбрионов в отдельные двухмиллилитровые микропробирки вскоре после инъекции и осторожно промойте эмбрионы стерильным PBS. Выбросив смывки, добавьте 100 микролитров стерильного PBS в каждую пробирку, а затем две-три стерильные шарики диоксида циркония диаметром два миллиметра.

Затем измельчите эмбрионы в гомогенизаторе при 3500 об/мин в течение 30 секунд и культивируйте гомогенат, как показано на рисунке.