Приготовление одноклеточного бактериального посева

Возьмите метаболически активную культуру Mycobacterium marinum. Это обеспечивает высокую жизнеспособность бактерий и оптимальное физиологическое состояние.

Центрифугируйте культуру для гранулирования бактерий.

Выбросьте излишки надосадочной жидкости и повторно суспендируйте гранулу в свежей среде, содержащей диспергирующий агент.

Перенесите суспензию в микроцентрифужные пробирки и обработайте ультразвуком в контролируемых условиях.

Ультразвуковая обработка разрушает бактериальные агрегаты и рассеивает клетки, в результате чего получается жизнеспособная суспензия одиночных клеток.

Соберите ультразвуковую суспензию в шприц и пропустите ее через мембранный фильтр, чтобы удалить оставшиеся комки, обеспечивая равномерную популяцию одиночных клеток.

С помощью спектрофотометра измерить оптическую плотность бактериальной суспензии.

Разбавить суспензию свежими криопротекторсодержащими средами до достижения нужной бактериальной концентрации с сохранением жизнеспособности клеток.

Аликвот готовую одноклеточную суспензию и храните ее при сверхнизких температурах. Криопротектор помогает сохранить жизнеспособность бактерий при длительном хранении.

После посева в соответствии с рукописью центрифугируйте культуру при 3000 G в течение 10 минут, чтобы собрать Mycobacterium marinum в виде гранул. Выбросьте все, кроме 300 микролитров надосадочной жидкости, и снова суспендируйте гранулу.

Добавьте три миллилитра среды 7H9 с 10% глицерина для дальнейшей повторной суспензии гранулы, а затем обработайте суспензию ультразвуком на водяной бане мощностью 100 Вт, с 15 секундами включения и 15 секундами выключения, в общей сложности на две минуты для достижения гомогената одной клетки. Перелейте бактериальную суспензию в шприц объемом 10 миллилитров и пропустите через пятимикронный фильтр, чтобы удалить любые бактериальные комки. С помощью спектрофотометра измерить оптическую плотность суспензии, и разбавить ее средой 7Н9, содержащей 10% глицерина, до наружного диаметра 600 в одной.

Разделите суспензию на 10 микролитров аликвот, и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия в морозильной камере для дальнейшего использования.