Количественная оценка амилоидов, индуцированных бактериальной инфекцией, с помощью флуоресценции тиофлавина Т

Возьмите кювету, содержащую рабочий раствор тиофлавина Т, специфического для амилоида флуоресцентного красителя, растворенного в фосфатно-солевом буфере.

Поместите кювету в спектрофлуориметр и запишите сигнал базовой флуоресценции.

Приостановите сканирование и снимите кювету.

Добавьте стерилизованный фильтром надосадочный слой культуры, собранный из эндотелиальных клеток легких, инфицированных вирулентными бактериями Pseudomonas .

Надосадочная жидкость содержит амилоидные агрегаты, которые представляют собой неправильно свернутые, богатые бета-листами белки.

Аккуратно перемешайте содержимое путем инверсии, чтобы обеспечить равномерное распределение.

Перезагрузите кювету в спектрофлуориметр и возобновите сканирование, чтобы получить сигнал флуоресценции на основе времени.

Тиофлавин Т специфически связывается с амилоидами, богатыми бета-листами, что приводит к усилению флуоресценции.

Выполните флуоресцентное сканирование с теми же настройками.

Увеличение флуоресценции относительно исходного уровня указывает на наличие и относительное обилие индуцированных инфекцией амилоидов в надосадочной жидкости культуры.

Чтобы количественно определить содержание амилоидов в надосадочной жидкости, добавьте