Количественная оценка амилоидов, индуцированных бактериальной инфекцией, с помощью флуоресценции тиофлавина Т

Возьмите кювету, содержащую рабочий раствор тиофлавина Т, специфического для амилоида флуоресцентного красителя, растворенного в фосфатно-солевом буфере.

Поместите кювету в спектрофлуориметр и запишите сигнал базовой флуоресценции.

Приостановите сканирование и снимите кювету.

Добавьте стерилизованный фильтром надосадочный слой культуры, собранный из эндотелиальных клеток легких, инфицированных вирулентными бактериями Pseudomonas .

Надосадочная жидкость содержит амилоидные агрегаты, которые представляют собой неправильно свернутые, богатые бета-листами белки.

Аккуратно перемешайте содержимое путем инверсии, чтобы обеспечить равномерное распределение.

Перезагрузите кювету в спектрофлуориметр и возобновите сканирование, чтобы получить сигнал флуоресценции на основе времени.

Тиофлавин Т специфически связывается с амилоидами, богатыми бета-листами, что приводит к усилению флуоресценции.

Выполните флуоресцентное сканирование с теми же настройками.

Увеличение флуоресценции относительно исходного уровня указывает на наличие и относительное обилие индуцированных инфекцией амилоидов в надосадочной жидкости культуры.

Чтобы количественно определить содержание амилоидов в надосадочной жидкости, добавьте 20 микролитров свежеприготовленного и отфильтрованного стокового раствора тиофлавина Т 50X к одному миллилитру PBS в кювете спектрофотометра объемом 1 миллилитр и загрузите разведенный образец на спектрофлуориметр.

Измерьте базовое флуоресцентное излучение с помощью возбуждения 425 нанометров. Сканирование флуоресцентного излучения от 450 до 575 нанометров с шагом в два нанометра. Затем настройте прибор на выполнение покадрового сканирования с использованием возбуждения 425 нм и излучения 482 нм со сбором данных каждые 0,2 секунды в течение 60 секунд.

Поставьте сканирование на паузу через 20 секунд и добавьте в кювету 10 микролитров стерилизованной фильтром надосадочной жидкости. После перемешивания методом инверсии снова загрузите кювету на спектрофлуориметр и возобновите сканирование по времени в течение последних 40 секунд. По завершении таймлапса выполните окончательное сканирование спектра флуоресцентного излучения с использованием исходных настроек сканирования.