Получение рекомбинантов Pseudomonas aeruginosa с двойным кроссинговером для таргетной делеции гена

Начните с посева рекомбинантной Pseudomonas aeruginosa в среде отбора антибиотиков.

Эти бактерии содержат нерепликативную плазмиду, интегрированную в геном рядом с бактериальным геном-мишенью, предназначенным для делеции.

Интеграция происходила через гомологичные последовательности, общие для плазмиды и генома, что приводило к одной кроссинговерной рекомбинации.

Плазмида кодирует ген устойчивости к антибиотикам и ген sacB , который придает чувствительность к сахарозе.

Поместите бактерии в среду, содержащую сахарозу, но не содержащую антибиотика, и инкубируйте.

Без давления антибиотика происходит вторая рекомбинация или двойной кроссинговер между гомологичными областями, в результате чего плазмида и ген-мишень иссекаются.

Во время размножения бактерий вырезанная плазмида не передается, что делает бактерии устойчивыми к сахарозе.

Поместите бактерии на неселективную среду и среду, содержащую сахарозу или антибиотик, и инкубируйте.

Рост на неселективной и сахарозной средах, но не на среде антибиотиков, подтверждает успешный двойной кроссовер.

Начните с выращивания одиночных кроссинговеров, рекомбинантных колоний в Pseudomonas Isolation Broth, или PIB. Инокулируйте и нанесите по 10 микролитров каждой культуры на предварительно подогретые пластины PIA с добавлением 10% сахарозы. Затем инкубируйте пластины в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию.

На следующий день достаньте тарелки из инкубатора и осмотрите их на предмет роста. В сахарозоустойчивой колонии должны быть двойные кроссоверные рекомбинанты. Используйте стерильные зубочистки, чтобы наложить не менее 20 колоний на предварительно подогретые пластины PIA, PIA с добавлением 10% сахарозы и PIA с добавлением карбенициллина.

Инкубируйте пластины на ночь и осмотрите их на предмет роста на следующий день. Настоящие рекомбинанты с двойным кроссовером будут чувствительны к карбенициллину и устойчивы к сахарозе.