Флуоресцентная покадровая визуализация жизненного цикла Streptomyces venezuelae

Возьмите микрофлюидную пластину с лункой, содержащей споры Streptomyces venezuelae, бактерии, образующей гифы.

Другие выделенные скважины содержат либо богатые питательными веществами, либо отработанные среды.

Споры получены из штамма, экспрессирующего флуоресцентные белки DivIVA и FtsZ, которые локализуются на концах гиф и поперечных стенках соответственно.

Нанесите иммерсионное масло на линзу объектива инвертированного микроскопа и на окно изображения пластины.

Установите пластину на предметный столик микроскопа и начните покадровую съемку.

Загрузите споры в камеру для культивирования планшета.

Затем введите богатую питательными веществами среду, чтобы инициировать прорастание спор.

По мере роста гиф DivIVA накапливается на концах гиф, в то время как FtsZ образует разрозненные кольца на поперечных стенках.

Далее переключитесь на отработанную среду. Недостаток питательных веществ в этой среде способствует спороношению.

В прорастающих гифах очаги DivIVA исчезают, а FtsZ перестраивается в регулярную лестницу из делительных колец, образуя споруляционные перегородки.

Со временем исчезновение флуоресценции FtsZ в тех же гифах подтверждает завершение споруляции.

Предварительно прогрейте климатическую камеру до 30 градусов Цельсия.

Затем включите микроскоп и программное обеспечение для управления микроскопом. Установите на место масляный иммерсионный объектив с высокой числовой апертурой и убедитесь, что соответствующие фильтры и диаграммные зеркала настроены для получения дифференциально-интерференционно-контрастных изображений, а также изображений слияния желтых флуоресцентных и красных флуоресцентных белков. Капните каплю иммерсионного масла в объектив и в нижнюю часть окна визуализации на микрофлюидной пластине.

Осторожно установите герметичное микрофлюидное устройство на предметное столико инвертированного микроскопа и закрепите его на месте. Используйте встроенные маркеры положения, чтобы сфокусировать окно визуализации микрофлюидной камеры для культивирования. Сосредоточьтесь на крайней левой части первой проточной камеры, обозначенной буквой А, а затем переместите столик на пятый размер ловушки, соответствующий высоте ловушки 0,7 микрометра.

В микрофлюидном программном обеспечении настройте систему на нагрузку ячеек из входного отверстия 8 при давлении 4 фунта на квадратный дюйм в течение 15 секунд. После запуска процесса проверьте плотность клеток в камере для культивирования, перемещая предметный столик по окну визуализации. Если споры не были захвачены, повторите этап загрузки клеток или, в качестве альтернативы, увеличьте давление загрузки и/или время до тех пор, пока не будет достигнута желаемая плотность клеток от одной до 10 спор на окно визуализации.

Следите за тем, чтобы не перегрузить камеру для культивирования. Затем запустите заранее подготовленную программу потока в управляющем программном обеспечении и дайте микрофлюидной пластине нагреться в течение одного часа на сцене микроскопа, прежде чем начать получение изображения. В программном обеспечении для управления микроскопом настройте многомерный сбор данных для получения нескольких изображений в нескольких положениях на разных этапах в течение определенного периода времени, предварительно указав каталог для автоматического сохранения файлов изображений.

Далее переходим в настройки освещенности и вводим заранее заданные оптимальные настройки освещенности для каждого конкретного конструктива. Затем настройте временные ряды для получения изображений каждые 40 минут в течение 24 часов. Чтобы определить положение сцены и установить автофокусировку, отсканируйте камеру для культуры и сохраните позиции сцены для каждой интересующей позиции изображения.

Убедитесь, что одноступенчатые позиции расположены достаточно далеко друг от друга, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание и фототоксичность. После проверки Z-координат выбранных положений сцены активируйте аппаратную автофокусировку. Затем запустите покадровую съемку в программном обеспечении для управления микроскопом.

Остановите получение изображения через 24–30 часов или после того, как гифы в исследуемой области дифференцируются в споры. Затем остановите проточную программу в программном обеспечении и разберите микрофлюидное устройство. Подготовьте используемую микрофлюидную пластину к кратковременному хранению, удалив остатки среды из входных отверстий, отработанного колодца и загрузочного отверстия ячейки.

Затем заполните используемые колодцы полосы А и колодцы неиспользуемых дорожек стерильным PBS. Наконец, заклейте тарелку грушевой пленкой, чтобы предотвратить ее высыхание. И храните тарелку при температуре четыре градуса Цельсия.