Мониторинг бактериальной инфекции и доставки эффекторных белков в растительные клетки

Начнем с экспериментального растения с генетически модифицированными областями листьев, экспрессирующими большие нефлуоресцентные фрагменты зеленого флуоресцентного белка superfolder или sfGFP.

Введите в эти модифицированные участки бактерии Pseudomonas , содержащие эффекторные белки, помеченные небольшим нефлуоресцентным фрагментом sfGFP.

Инкубируйте для обеспечения взаимодействия между бактериями и клетками листьев.

Используя специализированную систему секреции, Pseudomonas доставляет меченые эффекторные белки в цитозоль листа.

Близость между большим и малым фрагментами GFP позволяет собрать их в функциональную флуоресцентную sfGFP, которая затем перемещается на плазматическую мембрану.

После инкубации удалите листовые диски с инъекционных участков.

Визуализируйте эти диски с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа.

Первоначально визуализируйте листовой диск с низкой интенсивностью лазера, чтобы свести к минимуму автофлуоресценцию. Затем увеличьте мощность лазера для улучшения видимости.

Зеленая флуоресценция подтверждает успешную бактериальную инфекцию и доставку эффекторного белка в клетки растений.

Для листьев Nicotiana benthamiana инфильтрируйте суспензию Pseudomonas в ту же область, где агробактерия была инфильтрирована двумя днями ранее.

Наконец, вырежьте листовой диск из привитых Pseudomonas листьев. В определенные моменты времени после проникновения Pseudomonas используйте систему конфокального лазерного сканирования для получения изображений двух-двух квадратных сантиметровых листовых дисков одного растения. Наблюдайте за клетками вдали от инфильтрационного отверстия, чтобы избежать гибели мертвых клеток от ран.

Транслоцированные эффекторы из бактерий присутствуют только в очень малых количествах. Таким образом, вы можете увеличить мощность лазера и получить флуоресцентное излучение для обнаружения флуоресцентного сигнала. Тем не менее, не переусердствуйте, чтобы избежать захвата ложного сигнала от автофлуоресценции от растительных клеток.