Коинкубационный анализ для изучения конкурентных взаимодействий между штаммами бактерий

Начнем с двух бактериальных штаммов, эталонного и конкурентного, каждый из которых экспрессирует отдельный флуоресцентный маркер для идентификации штамма.

Смешайте штаммы в равных пропорциях и выложите смесь на агаровую пластину.

Инкубируйте планшет, чтобы штаммы могли расти и взаимодействовать.

Конкурент превосходит эталонную деформацию с помощью контактно-зависимых или контактно-независимых механизмов.

В контактно-зависимых соревнованиях участник использует специализированные системы секреции для доставки токсинов непосредственно в эталонный штамм.

В бесконтактно-независимых соревнованиях участник выделяет токсины, которые диффундируют в окружающую среду и попадают в эталонную деформацию.

Эти токсины нарушают основные процессы в референсном штамме, включая синтез клеточной стенки, репликацию ДНК и синтез белка, что приводит к остановке роста, гибели клеток и снижению экспрессии флуоресценции.

После инкубации осмотрите планшет под флуоресцентным микроскопом.

Пониженная флуоресценция в эталонной деформации по сравнению с более яркой флуоресценцией конкурента указывает на конкурентные взаимодействия.

Чтобы смешать эталонный штамм и конкурирующий штамм в соотношении один к одному, добавьте по 100 микролитров каждого штамма, нормализованного до наружного диаметра 1,0, в маркированную центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и переведите курсор на одну-две секунды. В качестве контроля смешайте эталонную деформацию с дифференциально помеченной версией себя и vortex.

Очень важно добиться правильного начального соотношения, так как оно может значительно изменить исход эксперимента. Чтобы обеспечить успех, этот шаг может потребовать оптимизации для данного вида бактерий. После повторения этого шага для каждой биологической репликации должны быть четыре биологические реплики с дифференциально мечеными референтными штаммами в качестве контроля и четыре биологические реплики с дифференциально мечеными референсными и конкурирующими штаммами.

Чтобы получить культуральные пятна, которые будут использоваться для флуоресцентной микроскопии после инкубации, добавьте по 10 микролитров каждой контрольной и экспериментальной смеси на пластину Петри, содержащую агар LBS. После того как пятна полностью высохнут на скамейке, выдерживайте пластины при температуре 24 градуса Цельсия в течение 24 часов.