Локализованная доставка бактерий в просвет кишечника личинки данио-рерио с помощью микроинъекции

Возьмите блюдо, содержащее личинку данио-рерио, находящуюся под наркозом.

Нанесите каплю легкоплавкой агарозы на личинку и аккуратно расположите ее сбоку, чтобы обеспечить доступ к кишечнику во время инъекции.

Теперь коротко охладите агарозу, чтобы она застыла, тем самым обездвижив личинку.

Добавьте среду, содержащую обезболивающее средство, чтобы поддерживать личинку под наркозом.

Затем возьмите суспензию патогенной бактерии Clostridioides difficile, меченной флуоресцентно, и добавьте индикаторный краситель для облегчения контроля за инъекцией.

Загрузите эту смесь в иглу для микроинъекций и установите иглу на микроманипулятор.

Под стереомикроскопом расположите иглу под углом, направленным к кишечнику личинок.

Затем аккуратно введите кончик иглы в просвет кишечника.

Введите бактерии непосредственно в просвет и подтвердите успешную доставку с помощью индикаторного красителя. Затем втяните иглу обратно.

С помощью флуоресцентной микроскопии подтвердить локализацию Clostridioides difficile в кишечнике личинок.

Сначала нанесите каплю 0,8% легкоплавкой агарозы на личинок данио-рерио в чашке Петри, чтобы накрыть крышкой. Аккуратно отрегулируйте личинки в боковое положение. Поместите чашку Петри на лед на 30-60 секунд, чтобы низкоплавкая агароза застыла.

Добавьте 30% среду Данио, содержащую от 0,02% до 0,04% трикаина, чтобы покрыть агарозу. Для приготовления раствора для инъекций добавьте один микролитр 0,5% фенолового красного в растворе PBS на девять микролитров окрашенного красителем Clostridioides difficile inoculum. Загрузите откалиброванную микроинъекционную иглу с раствором для инъекций с помощью микрозагрузчика.

Вставьте заряженную иглу в микроманипулятор и расположите ее под стереомикроскопом. Отрегулируйте давление впрыска в диапазоне от 600 до 900 гектопаскалей. Установите время впрыска от 0,1 до 0,3 секунды, чтобы получить от 0,5 до 1,0 нанолитров.

Установите иглу в микроманипулятор под углом примерно 45 градусов, указывая в сторону внедренных личинок. Поместите кончик иглы над желудочно-кишечным трактом, ближе к мочеполовой поре. Проткните через агарозу, затем мышцу кончиком иглы.

Затем введите его в просвет кишечника и введите от 0,5 до 1,0 нанолитров Clostridioides difficile. Используйте флуоресцентный микроскоп для наблюдения за введенными личинками и используйте гибкий наконечник микрозагрузчика, чтобы выбрать правильно введенных личинок для конфокальной визуализации.