Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 3:16 мин. • September 26th, 2025
Начните с образца воды, содержащего бактерии, передающиеся через воду, и отфильтруйте его, чтобы удалить мусор.
Переложите разведенный фильтрат на агаровые пластины с низким содержанием питательных веществ, каждая из которых содержит определенный антибиотик. Распределите фильтрат и инкубируйте.
Бактерии, несущие специфический ген устойчивости к антибиотикам, растут на соответствующих антибиотиковых пластинах и образуют колонии.
Подсчитайте колонии, чтобы определить колониеобразующие единицы (КОЕ), представляющие собой количество устойчивых к антибиотикам бактерий.
Выберите по одной колонии из каждой тарелки и подвесьте ее в стерильной дистиллированной воде.
Нагрейте суспензию, чтобы лизировать клетки и высвободить внутриклеточное содержимое, включая бактериальную ДНК, содержащую ген устойчивости к антибиотикам.
Центрифугируйте пробирки, чтобы отделить мусор и собрать надосадочную жидкость, содержащую ДНК.
Добавьте к извлеченной ДНК реагенты для амплификации.
Поместите трубки в термоамплификатор и запустите программу для амплификации определенного участка бактериальной ДНК.
Амплифицированная ДНК готова к анализу последовательности для выявления гена устойчивости к антибиотикам.
Обрабатывайте пробу воды асептично, фильтруя ее через стерильную муслиновую салфетку для удаления любых твердых частиц. Затем последовательно разбавляйте отфильтрованную пробу воды для дальнейшего анализа. Чтобы определить количество устойчивых к антибиотикам бактерий, добавьте антибиотики по отдельности в пробирки, содержащие 20 миллилитров стерильного расплавленного R2A-агара, модифицированного примерно при 40 градусах Цельсия.
Перемешайте, чтобы равномерно перемешать, и вылейте на стерильные пластины Петри, прежде чем агар застынет. Нанесите 100 микролитров бактериальной суспензии на соответствующие антибиотикосодержащие агаровые модифицированные планшеты. Инкубируйте планшеты при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия в течение 48 часов, а затем определите количество бактерий.
Для подготовки матрицы ДНК из изолятов для ПЦР с помощью стерильной зубочистки берут одну изолированную чистую колонию изолята, растущую на планшете Петри. Суспензируйте бактериальную колонию в 100 микролитрах стерильной двойной дистиллированной воды в микроцентрифужной пробирке и прокипятите ее на кипящей водяной бане или сухой бане в течение 10 минут при температуре 100 градусов Цельсия. Центрифугируйте суспензию при 10 000 г в течение двух минут, чтобы гранулировать мусор, и перенесите надосадочную жидкость в свежую стерильную микроцентрифужную пробирку для использования в качестве матрицы для сырой ДНК.
Чтобы амплифицировать V3-область гена 16S рРНК методом ПЦР, приготовьте 40 микролитров реакционной смеси в ПЦР-пробирке. Поместите пробирку в термоблок, и запустите соответствующую программу в термоамплификаторе PCR.