$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Возьмем, к примеру, культуру кишечной палочки .
Разведите культуру в свежей среде и инкубируйте ее, чтобы способствовать делению бактерий.
Далее разведите культуру в средах, содержащих ингибитор деления бактерий, и инкубируйте.
Бактерии продолжают расти, не делясь, образуя удлиненные нити.
Переложите культуру в свежую пробирку, затем центрифугируйте для гранулирования нитей и удаления надосадочной жидкости.
Промойте гранулу осмотическим стабилизатором, чтобы предотвратить лизис сферопластов. Удалите раствор.
Последовательно добавьте буфер, лизоцим, ДНКазу и хелатирующий агент. Инкубировать.
Хелатирующий агент дестабилизирует внешнюю мембрану нити.
Лизоцим разрушает обнаженный слой пептидогликана, в результате чего нити теряют форму и образуют сферические структуры, называемые сферопластами.
Кроме того, ДНКаза разлагает загрязняющую ДНК, выделяемую из поврежденных нитей.
Снова добавьте осмотический стабилизатор, перемешайте и инкубируйте.
Переложите суспензию в пробирку, содержащую буфер и центрифугу.
Удалите избыток надосадочной жидкости и ресуспендируйте сферопласты в буфере для последующего анализа.
Чтобы создать культуру на ночь, используйте стерильный наконечник микропипетки, чтобы перенести одну бактериальную колонию из твердого агарового планшета в культуральную пробирку объемом 14 миллилитров, содержащую от двух до трех миллилитров трехпроцентного соевого бульона триптиказы, TSB, для 16-21-часовой инкубации при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. Чтобы приготовить грамотрицательные сферопласты E. coli , разведите ночную культуру в соотношении один к 100, и 25 миллилитров TSB в колбе объемом 250 миллилитров, и верните бактерии в встряхивающий инкубатор еще на 2,5 часа. Когда раствор достигнет оптической плотности от 0,5 до 0,8 при 600 нанометрах, разведите культуру в соотношении один к десяти в свежем TSB в новой колбе объемом 250 миллилитров для второй 2,5-часовой инкубации с конечной эффективной концентрацией 60 микрограммов на миллилитр цефалексина.
Для производства одноклеточных нитей длиной от 50 до 150 микрометров, визуализированных под световым микроскопом при 1000-кратном увеличении. Центрифугируйте бактериальный раствор для сбора нитей и сцеживайте надосадочную жидкость. Промойте нити с аккуратным добавлением одного миллилитра 0,8 моляра сахарозы, стараясь не потревожить гранулы.
Через одну минуту выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулу, и добавьте указанные реагенты в соответствующем порядке к нитям. Через десять минут при комнатной температуре постепенно добавляйте один миллилитр раствора А в течение одной минуты, осторожно помешивая раствор вручную. Инкубируйте раствор в течение четырех минут при комнатной температуре, затем разделите суспензию нити на две равные аликвоты между двумя 15-миллилитровыми коническими пробирками, содержащими семь миллилитров четырехградусного раствора Цельсия В. Затем гранулируйте нити с помощью центрифугирования и с помощью серологической пипетки осторожно удалите все, кроме одного-двух миллилитров надосадочной жидкости, не нарушая гранулы.
С помощью микропипетки p1000 аккуратно восстановите суспендию гранул. Проверьте небольшую аликвоту образца на образование сферопластов с помощью световой микроскопии. Затем сферопласты можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение недели или до тех пор, пока они не пройдут три цикла замораживания и оттаивания.