Приготовление сферопластов E. coli

0 просмотров4:30 мин • September 26th, 2025

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возьмем, к примеру, культуру кишечной палочки .

Разведите культуру в свежей среде и инкубируйте ее, чтобы способствовать делению бактерий.

Далее разведите культуру в средах, содержащих ингибитор деления бактерий, и инкубируйте.

Бактерии продолжают расти, не делясь, образуя удлиненные нити.

Переложите культуру в свежую пробирку, затем центрифугируйте для гранулирования нитей и удаления надосадочной жидкости.

Промойте гранулу осмотическим стабилизатором, чтобы предотвратить лизис сферопластов. Удалите раствор.

Последовательно добавьте буфер, лизоцим, ДНКазу и хелатирующий агент. Инкубировать.

Хелатирующий агент дестабилизирует внешнюю мембрану нити.

Лизоцим разрушает обнаженный слой пептидогликана, в результате чего нити теряют форму и образуют сферические структуры, называемые сферопластами.

Кроме того, ДНКаза разлагает загрязняющую ДНК, выделяемую из поврежденных нитей.

Снова добавьте осмотический стабилизатор, перемешайте и инкубируйте.

Переложите суспензию в пробирку, содержащую буфер и центрифугу.

Удалите избыток надосадочной жидкости и ресуспендируйте сферопласты в буфере для последующего анализа.

Чтобы создать культуру на ночь, используйте стерильный наконечник микропипетки, чтобы перенести одну бактериальную колонию из твердого агарового планшета в культуральную пробирку объемом 14 миллилитров, содержащую от двух до трех миллилитров трехпроцентного соевого бульона триптиказы, TSB, для 16-21-часовой инкубации при температуре 37 градусов Цельсия с встряхиванием. Чтобы приготовить грамотрицательные сферопласты E. coli , разведите ночную культуру в соотношении один к 100, и 25 миллилитров TSB в колбе объемом 250 миллилитров, и верните бактерии в встряхивающий инкубатор еще на 2,5 часа. Когда раствор достигнет оптической плотности от 0,5 до 0,8 при 600 нанометрах, разведите культуру в соотношении один к десяти в свежем TSB в новой колбе объемом 250 миллилитров для второй 2,5-часовой инкубации с конечной эффективной концентрацией 60 микрограммов на миллилитр цефалексина.

Для производства одноклеточных нитей длиной от 50 до 150 микрометров, визуализированных под световым микроскопом при 1000-кратном увеличении. Центрифугируйте бактериальный раствор для сбора нитей и сцеживайте надосадочную жидкость. Промойте нити с аккуратным добавлением одного миллилитра 0,8 моляра сахарозы, стараясь не потревожить гранулы.

Через одну минуту выбросьте надосадочную жидкость, не потревожив гранулу, и добавьте указанные реагенты в соответствующем порядке к нитям. Через десять минут при комнатной температуре постепенно добавляйте один миллилитр раствора А в течение одной минуты, осторожно помешивая раствор вручную. Инкубируйте раствор в течение четырех минут при комнатной температуре, затем разделите суспензию нити на две равные аликвоты между двумя 15-миллилитровыми коническими пробирками, содержащими семь миллилитров четырехградусного раствора Цельсия В. Затем гранулируйте нити с помощью центрифугирования и с помощью серологической пипетки осторожно удалите все, кроме одного-двух миллилитров надосадочной жидкости, не нарушая гранулы.

С помощью микропипетки p1000 аккуратно восстановите суспендию гранул. Проверьте небольшую аликвоту образца на образование сферопластов с помощью световой микроскопии. Затем сферопласты можно хранить при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение недели или до тех пор, пока они не пройдут три цикла замораживания и оттаивания.

07:59

Экстракция и визуализация белковых агрегатов после лечения кишечной палочки протеотоксическим стрессором

Похожие видео

0 Просмотры

12:29

Популяционный и одноклеточный анализ персистенции антибиотиков при Escherichia coli

Похожие видео

0 Просмотры

15:00

Ежедневные переносы, архивирование популяций и измерение приспособленности в долгосрочном эволюционном эксперименте с Escherichia coli

Похожие видео

0 Просмотры

03:33

Подготовка и трансформация бактерий с помощью высоковольтной электропорации

Похожие видео

0 Просмотры

04:02

Образование сферопластов из грамотрицательных бактерий

Похожие видео

0 Просмотры

07:10

Быстрое Протокол по подготовке Электрокомпетентные

Похожие видео

0 Просмотры

11:19

Индуцирование сайта Конкретная репликации засорение E. палочки Использование системы Люминесцентные репрессора оператора

Похожие видео

0 Просмотры

12:28

Бактериальный Внутренняя мембрана-дисплей для скрининга библиотеки фрагментов антител

Похожие видео

0 Просмотры

10:34

Основные металлические поглощения в грамотрицательных бактерий: рентгеновская флюоресценция, радиоизотопов и клеточной фракционирования

Похожие видео

0 Просмотры

11:46

Производство белка эластина как гидрогели для инкапсуляции и иммуноокрашивания клеток в 3D

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 22 августа 2026