Приготовление сферопластов E. coli

Возьмем, к примеру, культуру кишечной палочки .

Разведите культуру в свежей среде и инкубируйте ее, чтобы способствовать делению бактерий.

Далее разведите культуру в средах, содержащих ингибитор деления бактерий, и инкубируйте.

Бактерии продолжают расти, не делясь, образуя удлиненные нити.

Переложите культуру в свежую пробирку, затем центрифугируйте для гранулирования нитей и удаления надосадочной жидкости.

Промойте гранулу осмотическим стабилизатором, чтобы предотвратить лизис сферопластов. Удалите раствор.

Последовательно добавьте буфер, лизоцим, ДНКазу и хелатирующий агент. Инкубировать.

Хелатирующий агент дестабилизирует внешнюю мембрану нити.

Лизоцим разрушает обнаженный слой пептидогликана, в результате чего нити теряют форму и образуют сферические структуры, называемые сферопластами.

Кроме того, ДНКаза разлагает загрязняющую ДНК, выделяемую из поврежденных нитей.

Снова добавьте осмотический стабилизатор, перемешайте и инкубируйте.

Переложите суспензию в пробирку, содержащую буфер и центрифугу.

Удалите избыток надосадочной жидкости и ресуспендируйте сферопласты в буфере для последующего анализа.

Чтобы создать культуру на ночь, используйте стерильный наконечник микропипетки, чтобы перенест