Исследование бактериальной реакции на этилен с использованием этилен-высвобождающего соединения

Начните с многолуночного планшета, содержащего питательную среду, предварительно инокулированную бактериями, производящими целлюлозу.

В обработанной скважине среду дополняют 2-хлорэтилфосфоновой кислотой (CEPA).

Закройте пластину для предотвращения газообмена и проведите инкубацию.

Во время инкубации CEPA гидролизует и высвобождает этилен, газообразную молекулу.

Этилен активирует бактериальную целлюлозную синтазу, которая использует цитозольную UDP-глюкозу для синтеза целлюлозы.

Со временем бактерии выдавливают целлюлозу через свою мембрану.

Это способствует самосборке бактерий на границе раздела воздух-жидкость, образуя плавающую биопленку на основе целлюлозы, или пленку.

После инкубации переложите пленки в свежую многолуночную пластину. Добавьте щелочной раствор и инкубируйте при более высокой температуре, чтобы лизировать клетки.

Удалите щелочной раствор. Многократно мойте с помешиванием, чтобы удалить клеточный мусор с сохранением целлюлозы.

Просушите и взвесьте пленки. Более высокая сухая масса в образцах, обработанных CEPA, по сравнению с контролем указывает на повышенное производство бактериальной целлюлозы в ответ на этилен.

Анализ пленки является стандартным инструментом анализа на производство бактериальной целлюлозы. PH и морфологический анализ подробно описываются в текстовом протоколе. При подготовке соберите клетки из стартовых культур в трех экземплярах и количественно оцените клетки с помощью счетной камеры Петрова-Гаузера.

Затем приготовьте четыре средние мастер-смеси с разной концентрацией CEPA. Для каждой мастер-смеси добавьте 60 миллилитров среды с pH 7 SH и добавьте 120 микролитров 0, 5, 50 или 500 миллимолярного стокового раствора CEPA, чтобы получить конечные концентрации CEPA 0, 0,01, 0,1 или 1,0 миллимоляра. Перемешайте эти среды, поворачивая колбы.

Для каждой из тройных групп необходим один набор сред, а для функционирования в качестве стерильного контроля необходим четвертый набор. Итак, разделите каждый 60 миллилитровый средний препарат на четыре аликвоты по 14 миллилитров. Затем предварительно охладите 14 миллилитров аликвот перед инокуляцией соответствующими заквасочными культурами для получения конечной концентрации 100 000 клеток на миллилитр.

Держите все инокулированные пробирки на льду, чтобы предотвратить образование целлюлозы. Используйте оставшиеся 14 миллилитров аликвот для стерильных контрольных лунок. Теперь из каждой 14-миллилитровой мастер-смеси загрузите два миллилитра аликвот в шесть лунок стерильной 24-луночной пластины, чтобы в общей сложности четыре загруженные чашки на каждую анализируемую закваску.

Тщательно запечатайте пластины парафиновой пленкой и инкубируйте их статически в течение семи дней при температуре 30 градусов Цельсия. Чтобы собрать пленку с пластины, нажмите на одну сторону пленки, чтобы приподнять противоположный край, и поднимите его щипцами.

Далее по отдельности переложите пленки в лунки шестилуночной пластины. Обработайте их 12 миллилитрами 0,1 нормального гидроксида натрия при температуре 80 градусов Цельсия в течение 20 минут, чтобы лизировать клетки. Затем удалите гидроксид натрия и нейтрализуйте обработанные пленки, тщательно промыв их 12 миллилитрами ультрачистой воды в течение 24 часов с перемешиванием в шестилуночной пластине.

Во время этой инкубации меняйте воду каждые шесть часов. Когда инкубация закончится, пленки должны быть белого цвета. Затем поместите пленки на силиконовые коврики и высушите их при температуре 50 градусов Цельсия в течение 48 часов, чтобы подготовить их к измерению сухого веса.