Амплификация плазмиды самоубийцы в бактериальном хозяине

Начните с бактериальной гранулы. Бактерии содержат ген, кодирующий инициирующий белок, но не имеют гена устойчивости к антибиотикам.

Повторно суспендируйте гранулу в охлажденной воде, чтобы свести к минимуму деградацию клеток.

Возьмем плазмиду, несущую ген устойчивости к антибиотикам и ген-мишень. Эту плазмиду называют плазмидой самоубийцы, потому что она не может реплицироваться без белка-инициатора.

Добавьте плазмиду в бактериальную суспензию.

Переложите суспензию в охлажденную кювету.

Инициируйте электропорацию путем подачи высоковольтного импульса, который временно разрушает бактериальную мембрану, позволяя плазмиде проникнуть внутрь.

Добавьте восстановительную среду и переложите смесь в питательную пробирку.

Инкубировать с встряхиванием.

Возьмите агаровую тарелку, содержащую антибиотик, и нанесите на нее культуру.

Бактериальный инициирующий белок связывается с источником репликации, позволяя плазмиде реплицироваться и экспрессировать белок, устойчивый к антибиотикам.

Это позволяет бактериям с плазмидой выживать и расти, способствуя амплификации плазмид.

Гранулируйте бактериальную культуру центрифугированием при температуре 5 000 G и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут. Суспензируйте гранулу в охлажденной дистиллированной воде и повторите процесс очистки еще два раза.

Перенесите бактериальную суспензию в микрофуговые пробирки и повторите центрифугирование при температуре 14 000 раз G и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. После повторного взвешивания гранулы в охлажденной воде добавьте примерно 3,5 микролитра смеси для лигирования и выдерживайте на льду в течение пяти минут. Переложите содержимое в охлажденную кювету с двухмиллиметровым зазором.

После электропорации добавьте среду SOC и переложите содержимое в культуральную пробирку. Выдерживать в течение часа при температуре 30 градусов Цельсия с встряхиванием при 200 об/мин. Планшеты трансформированных клеток на агаровых пластинах LB с добавлением хлорамфеникола.