Выделение грамотрицательных бактерий с помощью геномных транспозонных вставок

Начните с размораживания замороженной культуры спаренного донора и реципиентной популяции грамотрицательных бактерий на льду.

Клетки-реципиенты несут транспозоны, короткие сегменты ДНК, которые включают ген устойчивости к антибиотику канамицину. Эти транспозоны случайным образом интегрируются в геном хозяина.

Добавьте культуру в богатую питательными веществами агаровую тарелку, содержащую канамицин, но без донорских питательных веществ.

Добавьте стерильные бусины и аккуратно поверните тарелку, чтобы равномерно распределить культуру.

Удалите бусины и инкубируйте. Бактерии-реципиенты используют питательные вещества, но только те, у которых интегрированы транспозоны, устойчивы к канамицину, что приводит к образованию колоний.

Донорские и реципиентные бактерии без транспозонов не могут расти.

Подсчитайте колониеобразующие единицы, чтобы оценить количество бактерий-реципиентов с уникальными вставками транспозонов.

Добавьте свежие среды и соберите популяцию бактерий.

Центрифуга, чтобы удалить бактерии и выбросить надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте гранулу в среде с криопротектором для сохранения жизнеспособности бактерий.

Разморозьте аликвоту замороженной случки на льду. Затем с помощью стерильных стеклянных шариков нанесите 150 микролитров разбавленного вещества на каждую пластину агара Лурия-Бертани размером 30 на 150 миллиметров, дополненную канамицином.

Утилизируйте использованную пробирку, содержащую излишки сопряжения, и инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 14 часов. После инкубации подсчет колониеобразующих единиц на каждой пластине для оценки общего количества мутантов в библиотеке транспозонов. Сосчитайте 20% по крайней мере трех пластин, чтобы определить оценку количества колоний для всей группы пластин.

После расчета предполагаемой урожайности колонии добавьте от трех до пяти миллилитров LB в каждую пластину и соскребите бактерии с помощью стерильного скребка. Вытяните бактериальные суспензии из всех планшетов в конические пробирки объемом 50 миллилитров и гранулируйте суспензии центрифугированием при 5000 перегрузках в течение семи минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в пяти миллилитрах LB, дополненных 30% глицерином.

Затем сделайте один миллилитр аликвоты библиотеки транспозонов в криовиалах и храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.