Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 2:29 мин. • September 26th, 2025
Начните с планшета, содержащего предварительно выращенные РНК-интерференционные или экспрессирующие РНК-интерференцию бактерии.
Эти бактерии несут плазмиды, содержащие ген устойчивости к антибиотикам и генную вставку-мишень, которая производит двухцепочечную РНК или дцРНК для ингибирования специфической экспрессии генов в организме хозяина.
С помощью стерильной булавки перенесите колонии в глубоколуночный планшет, содержащий среду, обогащенную антибиотиками.
Инкубируйте тарелку с встряхиванием для равномерного роста бактерий, где глубокие лунки обеспечивают аэрацию.
Антибиотик уничтожает бактерии, у которых отсутствует плазмида, гарантируя, что выживают только бактерии, содержащие плазмиды.
Центрифугируйте планшет, чтобы отделить бактерии, и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте бактерии в буферном солевом растворе, чтобы стабилизировать их.
Диспонируйте ресуспендированные бактерии в многолуночный планшет, содержащий богатую питательными веществами среду, дополненную антибиотиком и индуктором.
Антибиотик отбирает плазмидные бактерии, в то время как индуктор запускает экспрессию дцРНК.
Планшет, засеянный бактериями, экспрессирующими РНК-интерференцию, готов к дальнейшим исследованиям.
Чтобы протестировать несколько штаммов бактерий РНК-интерференции параллельно в одной лунке 24-луночного планшета, инокулируйте одну колонию из каждого клона ранее приготовленных РНК-интерференциальных бактерий в четыре миллилитра карбенициллина, дополненного LB. Поместите планшеты в встряхивающий инкубатор, оптимизированный для многолуночных планшетов при температуре 37 градусов Цельсия и 950 оборотах в минуту на 16 часов. Затем соберите бактерии центрифугированием при температуре 2000 г в течение 5 минут. Сцедите надосадочную жидкость, перевернув тарелку и энергично встряхнув ее.
Использование 100 микролитров S базального ресуспендирования РНК-интерференции бактерий. Пипетку ресуспендированных бактерий в соответствующее количество лунок многолуночного планшета NGM с добавлением IPTG и карбенициллина и дайте планшету высохнуть.