Оценка индуцированной антибиотиками филаментации у E. coli с помощью анализа гальванических покрытий и проточной цитометрии

Начните с культуры кишечной палочки , предварительно обработанной антибиотиком.

Этот антибиотик блокирует деление клеток, в результате чего образуются удлиненные нитчатые клетки с повышенным содержанием ДНК.

Положите часть культуры на тарелку с богатым питательными веществами агаром и инкубируйте.

Нитевидные клетки не делятся, несмотря на продолжающийся рост; Только ненитевидные клетки образуют колонии, что приводит к низкому количеству колоний.

Разбавьте оставшуюся бактериальную культуру и добавьте флуоресцентный ДНК-связывающий краситель. Затем инкубируйте в темноте.

Краситель проникает в клетки и связывается с ДНК.

Сделайте образец вихревым потоком, а затем пропустите его через проточный цитометр.

Количество рассеянного света от каждой ячейки соответствует ее размеру.

Аналогичным образом, флуоресценция, испускаемая нуклеиновыми кислотами, связанными с красителем, указывает на содержание бактериальной ДНК.

Клетки, обработанные антибиотиками, демонстрируют повышенное рассеяние и флуоресценцию, отражая нитевидный рост и продолжающуюся репликацию ДНК без деления.

Это свидетельствует об изменениях в физиологии бактерий, вызванных антибиотиками, ингибирующими деление клеток.

Готовят десятикратные серийные разведения, до 10 до минус седьмой, из 200 мкл образца культуры в свежей среде.

Перемешивайте между каждым разбавлением очень осторожно вортексом или переворачивая трубку. Налейте 100 микролитров соответствующего разведения на неотобранные LB агарозные планшеты и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день подсчитайте количество колоний, чтобы определить концентрацию жизнеспособных клеток в каждом образце культуры.

Построите график КОЕ на миллилитр в зависимости от времени для необработанных и обработанных клеточных культур. Измерьте наружный диаметр 600 культуры на спектрофотометре. Разбавляют образец культуры свежей средой при четырех градусах Цельсия для получения образца с наружным диаметром 600 при 0,06, что соответствует примерно 15 000 клеток на микролитр.

Для окрашивания ДНК разведенный бактериальный образец смешать с раствором флуоресцентного красителя ДНК в соотношении 10 мкг на миллилитр в объемном соотношении один к одному и инкубировать в темноте в течение 15 минут. Перед введением образца перемешайте образец с помощью очень осторожного вортекса или путем переворачивания пробирки. Пропустите образец в проточный цитометр со скоростью потока примерно 120 000 клеток в минуту.

Получайте прямо-рассеянный и боковой свет, а также ДНК-флуоресцентный краситель/флуоресцентный сигнал с соответствующими настройками.