Производство рекомбинантного белка и восстановление из везикул, полученных из бактерий

Начните с культуры бактериального вида, который кодирует рекомбинантные белки, помеченные везикулярным нуклеирующим пептидом, или VNp, коротким пептидом, способствующим образованию везикул.

Добавьте в культуру индуктор и инкубируйте. Индуктор запускает экспрессию белка.

VNp встраивается во внутреннюю мембрану и способствует ее искривлению, инкапсулируя белки, помеченные VNp, в почковающиеся везикулы.

Переложите богатую пузырями среду в пробирку. Центрифугируйте его, чтобы отделить богатую везикулами надосадочную жидкость.

Далее отфильтруйте надосадочную жидкость, чтобы удалить остаточные загрязнения.

Затем пропустите фильтрат через другой мембранный фильтр для захвата везикул на поверхности мембраны.

Поместите мембрану в посуду и добавьте фосфатно-солевой раствор.

Аккуратно отсоедините пузырьки и переложите суспензию в чистую пробирку.

Ультразвуком нанесите суспензию, чтобы разрушить мембраны везикул и высвободить белки.

Центрифугируйте лизат для отделения фрагментов мембраны.

Полученная надосадочная жидкость содержит очищенные рекомбинантные белки, готовые к анализу.

Индуцируйте экспрессию рекомбинантного белка из промотора Т7 путем добавления IPTG до конечной концентрации до 20 микрограммов на миллилитр, или 84 микромоляра. Дав достаточно времени для индукции, гранулируйте клетки центрифугированием при 3000 g и 4 градусах Цельсия в течение 20 минут. Пропустите надосадочную жидкость через стерильный фильтр PES 0,45 микрона, не содержащий моющих средств, чтобы стерилизовать везикулы, содержащие среду, для длительного хранения.

Чтобы сконцентрировать везикулы в меньшем объеме, пропустите стерильные везикулы, содержащие среды, через стерильный фильтр MCE размером 0,1 микрона, не содержащий моющих средств. Затем аккуратно промойте мембрану от 0,5 до 1 миллилитра стерильного фосфатно-солевого буфера или PBS и используйте скребок для клеток или пластиковый разбрасыватель для тщательного удаления везикул с мембраны. Переложите концентрат везикулы в свежую микроцентрифужную пробирку с помощью пипетки.

Очищенные пузырьки можно хранить при температуре 4 градуса Цельсия. Ультразвуком обрабатывайте белок, содержащий везикулы, в стерильной среде, используя соответствующий график, чтобы разрушить везикулярные липидные мембраны и высвободить белок. Центрифугируйте ультразвуковую суспензию при 39 000 g и 4 градусах Цельсия в течение 20 минут, чтобы удалить везикулярный мусор.