Инактивация бактерий с помощью активируемого светом флавинмононуклеотида
JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 3:19 мин • September 26th, 2025
Начните с инокуляции патогенной бактерии в пробирку, содержащую жидкую среду.
Инкубируйте, чтобы способствовать размножению бактерий, затем переложите культуру в свежие пробирки.
Раскрутите ячейки в гранулы и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте бактериальные гранулы в буферных растворах, содержащих возрастающие концентрации флавинмононуклеотида (ФМН), фотосенсибилизатор и буферный раствор без ФМН в качестве контроля.
Тщательно перемешайте содержимое тубы и переложите суспензию в стеклянные пробирки.
Подвергните трубки воздействию видимого света, чтобы фотоактивировать FMN, который реагирует с молекулярным кислородом с образованием активных форм кислорода (АФК).
АФК повреждает бактериальные клеточные компоненты, тем самым снижая жизнеспособность бактерий.
Перенесите образцы аликвот на твердую среду, равномерно распределите их и инкубируйте, чтобы выжить жизнеспособным бактериям удалось вырасти в колонии.
После инкубации количественно оцените колонии и рассчитайте процентное снижение жизнеспособности бактерий по сравнению с контролем для оценки дозозависимого эффекта ФМН.
Инокулируйте колонию золотистого стафилококка в 10 миллилитров лизогенного бульона в 15-миллилитровую пробирку с завинчивающейся крышкой. Выращивайте культуру при температуре 37 градусов Цельсия в течение 16 часов в шейкере. Переложите 0,5 миллилитра культуры в 1,5-миллилитровую центрифужную пробирку.
Разбавьте культуру до оптической плотности 0,5 на 600 нанометрах путем добавления стерилизованной воды. Затем переложите 0,5 миллилитра культуры в 1,5-миллилитровую центрифужную пробирку. Центрифугируйте при 14 000 G в течение 10 минут и сцедите надосадочную жидкость.
Добавьте один миллилитр буферизованного раствора ФМН в ячейку и сделайте вихрь. Для контроля облучения добавьте один миллилитр фосфатного буфера. Перелейте один миллилитр раствора бактериальной клетки, содержащего 30-микромолярный ФМН и фосфатный буфер, в стеклянные пробирки.
Поместите их для излучения под фиолетовый свет мощностью 10 Вт на квадратный метр на 30 минут. Затем переведите один миллилитр раствора бактериальной клетки, содержащего 30, 60 и 120 микромолярных ФМН и фосфатный буфер, в стеклянные пробирки. Облучайте синим светом в течение 120 минут при мощности 20 Вт на квадратный метр.
Также облучают трубку, содержащую один миллилитр 120-микромолярного ФМН, в течение 60 минут. После облучения добавьте 0,2 миллилитра реакционного раствора на пластину с агаром Лурия. Распределите раствор с помощью Г-образного стеклянного стержня и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.
На следующий день рассчитайте количество жизнеспособных пластин и скорость инактивации золотистого стафилококка.
Обзор
В данном исследовании изучается влияние флавинмононуклеотида (FMN) в качестве фотосенсибилизатора на жизнеспособность бактерий. Путем воздействия на Staphylococcus aureus различными концентрациями FMN и светом в работе оценивается дозозависимый эффект влияния на выживаемость бактерий.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Фототерапия
- Антимикробная резистентность
Теоретические сведения
- Staphylococcus aureus является распространенной патогенной бактерией.
- FMN может генерировать активные формы кислорода (АФК) при фотоактивации.
- Известно, что АФК повреждают клеточные компоненты, влияя на жизнеспособность бактерий.
- Понимание эффектов FMN может привести к созданию новых антимикробных стратегий.
Цель исследования
- Оценить эффективность FMN в снижении жизнеспособности бактерий.
- Определить дозозависимые эффекты FMN при воздействии света.
- Изучить потенциальные возможности применения FMN в противомикробной терапии.
Используемые методы
- Инокуляция Staphylococcus aureus в жидкую среду.
- Инкубация и центрифугирование для получения бактериального осадка.
- Ресуспендирование в растворах FMN и воздействие светом.
- Количественное определение бактериальных колоний после инкубации для оценки жизнеспособности.
Основные результаты
- Воздействие FMN привело к значительному снижению жизнеспособности бактерий.
- Эффективность зависела от дозы: более высокие концентрации приводили к более выраженному снижению.
- Облучение светом имело решающее значение для активации FMN и последующей генерации ROS.
Выводы
- FMN является эффективным фотосенсибилизатором для снижения жизнеспособности Staphylococcus aureus.
- Данный метод может стать перспективным подходом к разработке новых противомикробных средств терапии.
- Необходимы дальнейшие исследования для оптимизации условий с целью применения в клинической практике.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Данный метод позволяет провести дозозависимую оценку эффективности фотосенсибилизатора в отношении патогенных бактерий, что способствует валидации противомикробных мишеней на ранних этапах. Путем количественного определения снижения жизнеспособности при контролируемом воздействии света обеспечивается механистическое снижение рисков для терапевтических концепций, основанных на АФК. Этот подход помогает приоритизировать кандидаты в фотосенсибилизаторы для доклинической разработки.
Стратегическое применение в исследованиях и разработках биофармацевтики
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Исследует терапевтическую гипотезу инактивации бактерий, опосредованной АФК.
- Практическая ценность: Обеспечивает функциональную валидацию механизмов действия фотосенсибилизаторов в системе, релевантной для данного заболевания.
- Прогностическая ценность: Способствует идентификации перспективных соединений-лидеров путем установления зависимости «доза-эффект» для FMN.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Подготовка стандартизированных бактериальных суспензий для обеспечения согласованности при скрининге соединений.
- Количественный результат: Получение данных о количестве жизнеспособных колоний на чашках, что позволяет проводить оценку по типу IC50.
- Воспроизводимость: Использование контролируемого светового облучения и дозирования FMN для обеспечения надежности анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: использование Staphylococcus aureus в качестве модельного патогена для трансляционного скрининга.
- Снижение механистических рисков: уточнение роли генерации АФК как ключевого механизма снижения жизнеспособности.
- Преклиническая преемственность: обоснование решений о дальнейшем продвижении исследования путем установления связи между дозой фотосенсибилизатора и биологическим эффектом.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Определяет место скрининга фотосенсибилизаторов между этапами идентификации хитов и оптимизации соединений-лидеров в поиске противомикробных средств.
- Биология открытий: Проверка гипотез, специфичных для конкретных путей, посредством генерации АФК и анализа клеточных повреждений.
- Скрининг: Получение воспроизводимых количественных показателей жизнеспособности для приоритезации соединений.
- Аналитика: Возможность расчета скорости инактивации и дозозависимых эффектов.
- Трансляционные исследования: Сопоставление результатов in vitro с профилем эффективности в отношении конкретных патогенов.
- Корпоративное повторное использование: Создание многократно используемой платформы для оценки различных фотосенсибилизаторов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает понимание механизмов действия фотосенсибилизатора.
- Операционная ценность: предлагает стандартизированный, масштабируемый рабочий процесс для оценки жизнеспособности.
- Стратегическая ценность: улучшает принятие решений о целесообразности дальнейшей разработки (go/no-go) за счет устранения неопределенности в антимикробном механизме.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию кандидатов в фотосенсибилизаторы с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуются навыки в области микробиологических методов и фотобиологии.
- Необходимы контролируемые источники света с определенной длиной волны и интенсивностью.
- Требуется стандартизация работы между исследовательскими группами для обеспечения единообразного приготовления FMN и облучения.
- Необходимо учитывать особенности адаптации для различных бактериальных штаммов или условий культивирования.
- Ограничения связаны с необходимостью использования темных контролей и стандартизации светового воздействия.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
In Vitro модель для изучения воздействия 5-аминолевулиновой кислоты-опосредованной фотодинамической терапии на золотистый стафилококк биопленки
Похожие видео
0 Просмотры
Стандартизированные анализы in vitro для визуализации и количественной оценки взаимодействий между нейтрофилами человека и биопленками золотистого стафилококка
Похожие видео
0 Просмотры
Скрининг in vitro на основе светодиодов для оценки фотоактивируемых молекул при бактериальной фотодинамической инактивации
Похожие видео
0 Просмотры
Синергетический эффект от видимого света и гентамицин на
Похожие видео
0 Просмотры
Количественная оценка инактивации бактерий, вызванной светом, путем генерации активных форм кислорода
Похожие видео
0 Просмотры
Микроскопическая оценка ингибирования образования биопленки, опосредованной ферментами
Похожие видео
0 Просмотры
Светоактивированная обработка бактериальных биопленок с использованием фотосенсибилизирующего прекурсора
Похожие видео
0 Просмотры
Обработка тромбоцитарных продуктов рибофлавином и ультрафиолетовым излучением для уничтожения бактерий
Похожие видео
0 Просмотры
Методы подавления бактериального Pyomelanin Производство и определить соответствующую увеличению чувствительности к окислительному стрессу
Похожие видео
0 Просмотры
В Vivo Исследовании антимикробной Синяя Светотерапии для Полирезистентного Acinetobacter baumannii Ожог инфекции с помощью биолюминесценции визуализации
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026