Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 2:23 мин. • September 26th, 2025
Начните с буферизованной реакционной смеси, содержащей L-метионин, донор электронов, нитросиний тетразолий или NBT, окислительно-восстановительный индикатор, и флавинмононуклеотид или FMN, фотосенсибилизатор.
Добавьте эту смесь в пробирку, содержащую бактериальную гранулу и вихрь.
Переложите раствор в стеклянную трубку.
Теперь облучите смесь фиолетовым светом, чтобы активировать FMN, который принимает электрон из L-метионина, образуя реактивный промежуточный продукт.
Этот промежуточный продукт передает электрон растворенному молекулярному кислороду, генерируя активные формы кислорода или АФК вблизи поверхности бактерий.
Образующиеся в результате АФК повреждают клеточные компоненты и снижают жизнеспособность бактерий.
АФК также восстанавливает НБТ до формазана, продукта синего цвета, который осаждается вблизи поверхности бактерий.
Переложите смесь в пробирку, центрифугируйте ее и выбросьте надосадочную жидкость.
Ресуспендируйте гранулу в органическом растворителе для растворения формазана.
Наконец, измерьте поглощение, чтобы определить индуцированную светом бактериальную инактивацию путем образования АФК.
Подготовьте образцы золотистого стафилококка, как описано ранее, чтобы получить клеточную гранулу. К 75 миллилитрам фосфатного буфера добавьте 0,1093 грамма L-метионина, 0,1 грамма NBT и 25 миллилитров раствора FMN.
Добавьте по одному миллилитру каждого раствора реагента с различными концентрациями ФМН в клеточные гранулы и вихрь. Облучайте растворы под фиолетовым светом мощностью 10 Вт на квадратный метр в течение 10 минут. Центрифугируйте смесь при 14 000 G в течение 10 минут и сцедите надосадочную жидкость.
Повторно суспендируйте гранулу в одном миллилитре диметилсульфоксида для извлечения восстановленного NBT. Запишите поглощение на уровне 560 нанометров.