Скрининг ингибиторов бактериальной мембраносвязанной пирофосфатазы с помощью колориметрического анализа

Бактериальная мембранная пирофосфатаза, или мППаза, гидролизует пирофосфат в ортофосфат, перекачивая ионы натрия через мембрану.

Чтобы оценить действие ингибитора на мППазы, добавьте в трубные полоски увеличивающиеся концентрации фосфатов.

Введите в пробирки испытуемые соединения, которые могут ингибировать мППазу, оставив одну из них с водой в качестве контроля.

Добавляйте встроенные в липосомы мППазы, полученные из термофильной бактерии Thermotoga maritima , во все пробирки, кроме стандартных.

Запечатайте и инкубируйте при оптимальной температуре для активации фермента.

Добавьте пирофосфат натрия, чтобы инициировать реакцию и высвободить ортофосфат.

Переместите пробирки на охлаждающую платформу, чтобы остановить реакцию, и центрифугу, чтобы удалить конденсат.

Добавьте реагент молибдат-аскорбат для реакции с ортофосфатом и образования фосфомолибдоновой кислоты.

Добавьте раствор арсенита-цитрата для снижения кислотности, образуя устойчивый синий комплекс.

Переложите содержимое на многолуночный планшет и измерьте поглощение.

Более низкая абсорбция по сравнению с контролем указывает на ингибирование мППазы, в то время как стандарты служат эталоном для количественного определения фосфатов.

Добав