JoVE Encyclopedia of Experiments
Микробиология
0 просмотров • 2:15 мин • October 30th, 2025
Возьмите за образец слайд, содержащий спящие бактериальные споры и флуоресцентные микросферы.
Споры несут красные и зеленые флуоресцентные репортеры для белков прорастания, а внутренняя мембрана окрашена липофильным красителем.
Установите предметное стекло на микроскоп со структурированным освещением или SIM, оснащенный масляным иммерсионным объективом.
Найдите флуоресцентные микросферы и отрегулируйте фокус, чтобы свести к минимуму размытие изображения.
Затем используйте проходящий свет для обнаружения бактериальных спор.
Переключитесь в режим SIM и подсветите споры, чтобы возбудить флуорофоры.
Получение флуоресцентных изображений с высоким разрешением по всей толщине спор.
На внутренней мембране, окрашенной липофильным красителем, белки прорастания проявляются в виде отчетливых красных и зеленых очагов. Это позволяет точно картировать расположение белков прорастания в бактериальных спорах.
Для получения изображений образцов поместите предметное стекло на микроскоп со структурированным освещением, оснащенный 100-кратным масляным объективом, и сфокусируйтесь на 100-нанометровых флуоресцентных микросферах.
Отрегулируйте корректирующее кольцо на 100-кратном объективе до тех пор, пока не будет получена функция симметричного разброса точек, чтобы свести к минимуму размытие изображений, и выберите поле зрения с примерно 10 круглыми флуоресцентными микросферами. Примените регулировку фокуса решетки для назначенных длин волн возбуждения, в данном случае 561 и 488 нанометров, в качестве ориентира для программного обеспечения для анализа изображений, прежде чем фокусироваться на спорах с просвечивающим светом. Съемка изображения с просвечивающим светом в режиме 16-кратного усреднения с экспозицией 20 миллисекунд для каждого изображения.
Затем сделайте 3D-структурированные световые микроскопы необработанные флуоресцентные изображения спор в режиме подсветки 3D-SIM.