Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 2:04 мин. • October 30th, 2025
Начните с клеток амебы дикого типа Dictyostelium discoideum, подвешенных в холодном буфере.
Буфер обеспечивает ионную среду, которая поддерживает стабильность мембраны.
Далее добавьте клетки амебы в пробирку, содержащую плазмиду с геном-мишенью.
Аккуратно перемешайте раствор, чтобы плазмиды вступили в тесный контакт с поверхностью амебы.
Переложите эту смесь в предварительно охлажденную электропорационную кювету и проведите электропорацию.
Во время электропорации электрические импульсы создают переходные поры в клеточной мембране.
Плазмида проникает через эти поры в цитоплазму и впоследствии перемещается в ядро.
Затем перенесите клетки амебы в чашку Петри, содержащую жидкую среду с добавлением питающих бактерий.
Амеба потребляет бактерии через фагоцитоз, обеспечивая необходимые питательные вещества для восстановления клеток и обеспечивая экспрессию плазмид.
Питающие бактерии поддерживают трансфекцию в клетках амеб дикого типа, без необходимости в специальных штаммах, которые растут без бактерий.
Восстановите суспендию ячеек в буфере H40.
Далее добавьте 100 микролитров клеток в пробирку, содержащую один-два микрограмма ДНК. Пипеткой вверх и вниз перемешивайте и переносите смесь клеточной ДНК в предварительно охлажденную электропорационную кювету.
Не добавляйте более двух микрограммов ДНК. Более высокая концентрация ДНК токсична для клеток и снижает эффективность.
После электропорации немедленно перенесите клетки в подготовленную 10-сантиметровую чашку Петри и дайте клеткам восстановиться в течение пяти часов.