$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Возьмите бактериальный лизат, содержащий гидрофильные белки, липопротеиды и белковые агрегаты.
Добавьте холодное неионогенное моющее средство, способное к разделению фаз при более высоких температурах.
Инкубируйте на льду и периодически перемешивайте. Моющее средство связывается с липидным фрагментом липопротеина, образуя белково-моющие комплексы.
Нагрейте смесь, чтобы вызвать разделение фаз. Липопротеины концентрируются в детергентной фазе, в то время как гидрофильные белки остаются в водной фазе.
Центрифугируйте при комнатной температуре для поддержания двухфазного разделения.
Выбросьте водную фазу, добавьте холодный буфер к моющей фазе и перемешайте.
Повторите цикл охлаждения, нагревания и центрифугирования, чтобы обогатить липопротеины.
Затем добавьте холодный буфер и центрифугу при низкой температуре, чтобы гранулировать нелипопротеиновые агрегаты.
Перенесите надосадочную жидкость в пробирку, содержащую растворитель, осаждающий белки, и инкубируйте при минусовой температуре до осаждения липопротеинов.
Центрифугируйте при комнатной температуре и выбросьте надосадочную жидкость.
Осажденные липопротеины готовы к последующим исследованиям.
Дополните надосадочную жидкость поверхностно-активным веществом TX-114 до конечной концентрации 2%, добавив равный объем 4% поверхностно-активного вещества в ледяной TBSE. Инкубируйте добавленную надосадочную жидкость на льду в течение одного часа, перемешивая путем инверсии каждые 15 минут. Поместите трубку на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы вызвать разделение фаз.
Центрифугируйте образец при 10 000 умноженных на g в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы сохранить двухфазное разделение. Аккуратно отпижите верхнюю водную фазу и выбросьте. Добавьте ледяной TBSE в нижнюю фазу поверхностно-активного вещества, чтобы наполнить пробирку до исходного объема и перемешать.
Выдерживать на льду в течение 10 минут. После инкубации поместите пробирку на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы вызвать разделение фаз, затем центрифугируйте при 10 000 раз больше g в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторив эти шаги еще раз в общей сложности три разделения, удалите верхнюю водную фазу и выбросьте.
Удалите гранулы осажденных белков, образовавшихся в ходе экстракции, добавив один объем ледяного TBSE в фазу поверхностно-активного вещества. Центрифугируйте при температуре четыре градуса Цельсия и 16 000 раз больше g в течение двух минут, чтобы измельчить нерастворимый белок. Немедленно перенесите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 миллилитров, содержащую 1 250 микролитров 100% ацетона.
Перемешайте образец методом инверсии и инкубируйте в течение ночи при температуре минус 20 градусов Цельсия до осаждения белка. На следующий день центрифугируйте образец при 16 000 раз g в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать липопротеины с учетом ориентации пробирки. Дважды промойте гранулу 100% ацетоном перед сцеживанием ацетона и дайте образцу высохнуть на воздухе.
Затем добавьте от 20 до 40 микролитров 10-миллимолярного Tris-HCL, pH 8,0, и тщательно ресуспендируйте гранулу путем пипетирования вверх и вниз у стенки с осажденными липопротеинами.