Энциклопедия экспериментов JoVE
Микробиология
0 просмотров • 2:01 мин. • October 30th, 2025
Возьмем колонку для эксклюзионной хроматографии, набитую пористыми сферическими гелевыми шариками.
Уравновесьте колонку буфером, который сохраняет структурную целостность белков при разделении.
Загрузите очищенный бактериальный экстракт, содержащий рекомбинантно экспрессированные белки Р-домена норовируса человека и остаточные белковые примеси.
Добавьте буфер, чтобы пропустить образец через столбец.
Крупные остаточные загрязнения не могут проникнуть в поры и пройти через промежутки между бусинами, высвечиваясь первыми.
Контролируйте элюирование с помощью поглощения УФ-излучения. Небольшой пик указывает на примеси, выходящие из колонки.
Напротив, малые белки Р-домена проникают в поры гранул, проходят более длинный путь и позже элюируются. Повышение пика поглощения указывает на элюирование белков Р-домена.
Соберите элюированные фракции, содержащие белки Р-домена, которые теперь готовы к дальнейшему анализу.
Промойте насосы и трубопроводы высокоэффективной системы очистки жидкостной хроматографии и предварительно уравновесьте колонку эксклюзионной хроматографии с помощью буфера для фильтрации гелем. Введите домен P в колонку со скоростью потока один миллилитр в минуту, используя суперпетлю или петлю, в зависимости от объема концентрированной пробы. После того, как инъекция будет закончена, увеличьте скорость потока до 2,5 миллилитров в минуту.
По мере того как оптическая плотность увеличивается, и домен P отрывается от колонки, собирают доли по 1,5 миллилитров. Домен P обычно элюируется в виде димера.