Процедура очистки белка, меченного полигистидином, из Streptococcus mutans

Возьмем культуру Streptococcus mutans , экспрессирующую белок, меченный полигистидином, секретируемый в среду.

Центрифугируйте культуру и соберите богатую белком надосадочную жидкость.

Добавьте сульфат аммония и инкубируйте при перемешивании для выпадения белков в осадок за счет снижения их растворимости.

Переложите раствор в пробирку, центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте гранулу в связующем буфере, содержащем соли и низкое содержание имидазола, для стабилизации белка.

Диализируйте раствор против свежего связующего буфера, чтобы удалить излишки солей.

Центрифугируйте диализованный раствор для гранул нерастворимого мусора, затем отфильтруйте надосадочную жидкость.

Смешайте фильтрат с заряженной никелем аффинной смолой и инкубируйте, чтобы обеспечить селективное связывание белка, меченного полигистидином, с ионами никеля.

Загрузите смесь на хроматографическую колонку и промойте связывающим буфером для удаления несвязанных белков.

Затем добавьте элюирующий буфер с высоким содержанием имидазола, чтобы вытеснить гистидин из ионов никеля и высвободить белок, меченный полигистидином.

Соберите этот элюат, содержащий очищенные белки.

Центрифугируйте суспензию бактериальной кул