Процедура очистки белка, меченного полигистидином, из Streptococcus mutans

Возьмем культуру Streptococcus mutans , экспрессирующую белок, меченный полигистидином, секретируемый в среду.

Центрифугируйте культуру и соберите богатую белком надосадочную жидкость.

Добавьте сульфат аммония и инкубируйте при перемешивании для выпадения белков в осадок за счет снижения их растворимости.

Переложите раствор в пробирку, центрифугу и выбросьте надосадочную жидкость.

Ресуспендируйте гранулу в связующем буфере, содержащем соли и низкое содержание имидазола, для стабилизации белка.

Диализируйте раствор против свежего связующего буфера, чтобы удалить излишки солей.

Центрифугируйте диализованный раствор для гранул нерастворимого мусора, затем отфильтруйте надосадочную жидкость.

Смешайте фильтрат с заряженной никелем аффинной смолой и инкубируйте, чтобы обеспечить селективное связывание белка, меченного полигистидином, с ионами никеля.

Загрузите смесь на хроматографическую колонку и промойте связывающим буфером для удаления несвязанных белков.

Затем добавьте элюирующий буфер с высоким содержанием имидазола, чтобы вытеснить гистидин из ионов никеля и высвободить белок, меченный полигистидином.

Соберите этот элюат, содержащий очищенные белки.

Центрифугируйте суспензию бактериальной культуры в течение 20 минут при 10 000 умноженных на g при четырех градусах Цельсия.

Переложите надосадочную жидкость культуры в трехлитровый стеклянный стакан. Чтобы сконцентрировать белки из надосадочной жидкости культуры, поместите двухлитровую надосадочную жидкость на магнитную мешалку и начните энергичное перемешивание. Добавьте 1 122 грамма сульфата аммония и дайте осадку образоваться при энергичном перемешивании при температуре четыре градуса Цельсия в течение 4 часов или в течение ночи.

Затем центрифугируйте осажденный раствор сульфата аммония в 15 000 раз больше g в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. Сцедите надосадочную жидкость. С помощью шпателя соберите осадок и переложите его в стеклянный стакан объемом 200 миллилитров.

Повторно суспендируйте гранулы в 35 миллилитрах связующего буфера. Затем перелейте каждый примерно по 25 миллилитров суспензии в регенерированную целлюлозную диализную трубку. Поместите диализную трубку в 2,5 литра связующего буфера для перемешивания на мешалке при температуре четыре градуса Цельсия для диализа суспензии.

Замените диализный раствор через два часа и продолжайте диализ в течение ночи. Затем перенесите диализованную суспензию из трубки в центрифужные пробирки и поместите пробирки в центрифугу при температуре 20 000 раз больше g на 10 минут при четырех градусах Цельсия. С помощью оборудования для всасывающей фильтрации налейте надосадочную жидкость через мембранный фильтр толщиной 0,2 микрометра для фильтрации.

Перелейте фильтрат в колбу объемом 75 миллилитров.

Чтобы фракционировать меченный полигистидином gtfSI из фильтрованной суспензии, сначала готовят иммобилизованную металлоаффинную хроматографию. Уравновесив смолу согласно манускрипту, закройте песком Хоффмана.

Добавьте в колонку пять миллилитров отфильтрованной суспензии, чтобы получилась кашица. Затем переложите всю кашицу в оставшуюся отфильтрованную суспензию и аккуратно взбалтывайте смесь в течение 30 минут при температуре четыре градуса Цельсия. Загрузите смесь обратно в колонну.

Откройте пережимательный кран Хоффмана, чтобы снять суспензию под действием силы тяжести. Промойте смолу IMAC 20 миллилитрами связующего буфера, а затем выведите 20 миллилитров элюирующего буфера для получения рекомбинантного gtfSI.