Измерение связывания препарата с казеумом из пораженных туберкулезом методом быстрого равновесного диализа

Возьмем однородную суспензию казеума — некротического, богатого липидами материала из поражений туберкулеза, в основе которого лежат устойчивые к лекарствам микобактерии.

Добавляйте испытуемый препарат в гомогенат и вихрь, чтобы облегчить его взаимодействие с казеумной матрицей.

Поместите в опорную пластину быструю равновесную диализную вставку, содержащую донорскую и реципиентную камеры, разделенные полупроницаемой мембраной.

Загрузите гомогенат с лекарственным препаратом в донорскую камеру и добавьте буфер в приемную камеру.

Запечатайте пластину и инкубируйте с вращением.

Во время инкубации свободный препарат диффундирует по мембране, достигая равновесия между обеими камерами.

Как только равновесие будет достигнуто, разбавьте донорский образец буфером, а образец реципиента — гомогенатом, не содержащим лекарств, чтобы нормализовать матричные условия для количественного определения лекарственного средства.

Наконец, количественно определите концентрацию препарата и рассчитайте несвязанную фракцию препарата или fu.

Фу отражает свободное лекарство, доступное для диффундирования в казеум и достижения устойчивых к лекарствам микобактерий.

Добавьте 6,5 микролитров приготовленного исследуемого состава к 643,5 микролитрам гомогената. Для достижения конечной концентрации пять микромоляров и вихревых.

Далее поместите красные вставки в опорную плиту. Подготовьте вкладыши для каждого теста, каждое соединение в трех экземплярах.

Добавьте 200 микролитров матрицы с лекарственными вставками в красную донорскую камеру каждого красного вкладыша. Затем добавьте по 350 микролитров PBS в каждую камеру приемника.

Поместите клейкое уплотнение на пластину и инкубируйте его при температуре 37 градусов Цельсия на термомиксере со скоростью 200 оборотов в минуту в течение четырех часов. После инкубации аккуратно перемешайте содержимое донорской и реципиентной камер, пипетируя вверх и вниз два-три раза. Перенесите по 20 микролитров гомогената из каждой из донорских камер в 20 микролитров чистого PBS в пробирке объемом 1,5 миллилитров.

Аналогичным образом перенесите 20 микролитров аликвот образцов PBS из камер приемника в 20 микролитров чистого гомогената.

Матричное согласование устраняет необходимость в создании двух отдельных цветовых кривых зрения в гомогенате и PBS для количественного анализа. Содержимое донорской камеры со временем может осадиться. Аккуратно перемешайте содержимое с помощью пипетки перед удалением аликвот.