Микрофлюидная покадровая микроскопия для изучения персистенции антибиотиков у бактерий

Начните с экспоненциально растущих бактериальных клеток, экспрессирующих флуоресцентно меченный ДНК-связывающий гибридный белок, чтобы визуализировать нуклеоид.

Добавьте клетки к входным отверстиям заранее подготовленной микрофлюидной пластины.

Затем введите среды, содержащие антибиотики, и среды, не содержащие антибиотиков, в отдельные входные отверстия для раствора.

Запечатайте пластину, установите ее на предметный столик микроскопа и начните покадровую съемку.

Сначала загрузите клетки в камеру для культивирования.

Затем перфузируйте в камеру среды, не содержащие антибиотиков, чтобы поддерживать экспоненциальный рост клеток.

Наконец, вводят среды, содержащие антибиотики.

Антибиотик вызывает двухцепочечные разрывы ДНК, убивая восприимчивые клетки. Эти клетки демонстрируют уплотненные, нереплицирующиеся нуклеоиды со стабильной флуоресценцией.

Вернитесь к средам, не содержащим антибиотиков, чтобы ускорить выздоровление.

Персистирующие клетки — небольшая субпопуляция, которая выживает после лечения антибиотиками — возобновляют репликацию ДНК, удлиняются и делятся.

Это восстановление приводит к увеличению флуоресценции в персистентных клетках, что позволяет визуально отличать их от восприимчивых клеток.

Удалите консервирующий раствор из каждой лунки микрофлюидного планшета и замените его свежей питательной средой. Загерметизируйте микрофлюидную пластину с помощью системы коллектора, нажав на кнопку «Seal» или с помощью программного обеспечения microfluidic.

Затем в интерфейсе микрофлюидного программного обеспечения выполните первую последовательность прайминга, нажав кнопку «Запустить последовательность жидкостного прайминга». Инкубируйте планшет в термостатическом шкафу микроскопа при температуре 37 градусов Цельсия в течение как минимум двух часов перед началом микроскопической визуализации. Затем запустите вторую последовательность жидкостного прайминга перед началом эксперимента.

Запечатайте микрофлюидную пластину, нажав «Распечатать пластину» в интерфейсе программного обеспечения микрофлюидной жидкости. Замените среду в лунках 200 микролитрами свежей среды, содержащей антибиотик, и разведенным образцом культуры 0,01 OD в свежей среде. После герметизации микрофлюидной пластины, как показано ранее, поместите пластину на объектив микроскопа внутри корпуса микроскопа.

В микрофлюидном программном обеспечении нажмите на кнопку «Запустить последовательность загрузки ячеек», чтобы разрешить загрузку ячеек в микрофлюидную пластину. Установите оптимальный фокус с помощью режима проходящего света и выберите несколько областей интереса, где можно наблюдать соответствующее количество ячеек до 300 ячеек на поле. В микрофлюидном программном обеспечении отредактируйте команду Run a Custom Sequence, чтобы запрограммировать закачку свежей среды со скоростью 6,9 кПа в течение шести часов в первую и вторую скважины, затем среду, содержащую антибиотик, со скоростью 6,9 кПа в течение шести часов в третью скважину и, наконец, свежую среду со скоростью 6,9 кПаскалей в течение 24 часов в четвертую и пятую скважины.

Выполните микроскопическую визуализацию в режиме покадровой съемки с одним кадром каждые 15 минут с использованием проходящего света и источника возбуждающего света для флуоресцентного репортера и запустите микрофлюидную программу. Откройте программное обеспечение ImageJ или Fiji на компьютере и перетащите изображения интервальной микроскопии Hyperstack на панель загрузки Fiji. Используйте Image, затем Color, а затем Make Composite, чтобы объединить различные каналы гиперстека.

Используйте Изображение, Цвет, а затем Расположить каналы, если каналы не соответствуют нужному цвету. Откройте плагин MicrobeJ и определите бактериальные клетки с помощью интерфейса ручного редактирования. Удалите автоматически обнаруженные ячейки и вручную обведите интересующие вас постоянные ячейки кадр за кадром.

После обнаружения используйте значок «Результат» в интерфейсе ручного редактирования MicrobeJ, чтобы создать таблицу ResultJ. Используйте таблицу ResultJ для получения представления о различных параметрах, представляющих интерес для анализа с использованием отдельных ячеек, и сохраните файл ResultJ.