Скрининг циклических модуляторов di-GMP с использованием бактерий, экспрессирующих флуоресцентный репортерный белок

Возьмите многолуночный планшет, содержащий генетически модифицированные патогенные бактерии, выращенные с использованием различных тестовых соединений, а также отрицательный контроль.

Бактерии несут плазмиду с геном, кодирующим зеленый флуоресцентный белок или GFP.

Промотор гена активируется белком, который реагирует на внутриклеточные циклические концентрации di-GMP или c-di-GMP.

Поместите пластину в считыватель пластин.

Используйте отрицательный контроль, который максимально флуоресцирует благодаря отсутствию ингибитора c-di-GMP, для регулировки настроек для оптимального измерения сигнала флуоресценции.

Если тестируемое соединение ингибирует образование c-di-GMP, внутриклеточный уровень c-di-GMP снижается.

Снижение уровня c-di-GMP вызывает конформационные изменения в белке, что приводит к подавлению промотора и низкой экспрессии GFP, что приводит к снижению флуоресценции.

Измерьте флуоресценцию и проанализируйте данные для выявления тестовых соединений, которые модулируют внутриклеточные уровни c-di-GMP в патогенных бактериях.

Примерно за 30 минут до спектрофотометрического измерения предварительно нагрейте считыватель пластин до 37 градусов Цельсия, чтобы избежать образования конденсата