Анализ жизнеспособности микрокистоза энегнойной палочки с помощью проточной цитометрии

Возьмите отдельные образцы живых и мертвых клеток Microcystis aeruginosa .

Смешайте выборки, чтобы создать объединенную популяцию.

Микроцистис содержит фикоцианин, аутофлуоресцентный пигмент, который остается нетронутым в живых клетках, но разлагается в мертвых клетках.

Сделайте образец вихревым слоем, чтобы разбить комки и получить однородную одноклеточную суспензию.

Добавьте непроницаемый для клеточной мембраны, связывающий нуклеиновые кислоты флуоресцентный зонд и инкубируйте образец в темноте, чтобы предотвратить фотообесцвечивание.

Зонд избирательно проникает в мертвые клетки через их поврежденные мембраны и связывается с внутриклеточной ДНК.

Пропустите образец через проточный цитометр для измерения автофлуоресценции фикоцианина и флуоресценции зонда нуклеиновых кислот с помощью соответствующих лазеров с длиной волны возбуждения.

Живые клетки излучают сильную фикоцианиновую автофлуоресценцию, но не проявляют зондового сигнала.

Напротив, мертвые клетки демонстрируют сниженную эмиссию пигмента и повышенную флуоресценцию зонда, что подтверждает повреждение мембраны.

Это позволяет отличать богатые пигментом живые клетки от мертвых.

Чтобы оптимизировать поглощение молекулярных зондовых клеток, подвергните половину предварительно подготовленной монокультуры воздействию соответствующих условий для создания мертвого контроля. Проверьте изменения в микроокружении образца, чтобы подтвердить гибель культуры. А затем разукрупните образование колоний, как только что продемонстрировано.

Затем выберите 488-нанометровый лазер вместе с детектором, который может регистрировать флуоресценцию от зеленого и оранжевого зондов нуклеиновых кислот. И 640-нанометровый лазер для регистрации сигналов фикоцианина через соответствующие детекторы.